Construction of biosensors detecting secondary metabolites in Streptomyces

Actinomyceten und insbesondere Streptomyces, produzieren eine Vielzahl von Naturstoffen, welche vor allem im Bereich der Medizin und Landwirtschaft genutzt werden. Globale Probleme wie der Anstieg der Krebsinzidenz, die zunehmende bakterielle Resistenz gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen und die steigende Resistenz von Organismen gegenüber Pestiziden machen die Entdeckung neuer Wirkstoffe erforderlich. Die Gene, welche für die Produktion eines Sekundärmetaboliten verantwortlich sind, liegen im Genom von Streptomyces als Cluster vor. Diese Sequenzen werden als Biosynthese Gencluster (BGC) bezeichnet. Mit Hilfe von genome mining können BGCs identifiziert werden. Viele dieser BGCs produzieren ihren zugehörigen Metaboliten nur unter bestimmten Bedingungen in ihrer natürlichen Umgebung und bleiben unter Laborbedingungen stumm. Es gibt verschiedene Ansätze, um einen stillen BGC zu aktivieren; eine davon ist die Überexpression regulatorischer Gene. Biosensoren können helfen, den analytischen Aufwand nach Aktivierungsexperimenten zu reduzieren. Für dieses Projekt wurden fünf TetR-ähnliche Repressoren aus Region 2.34 von Streptomyces RLA012, isoliert aus der Rhizosphäre von Leontopodium nivale subsp. alpinum, ausgewählt, um rekombinante Biosensorstämme zu erzeugen, um die Aktivität dieses BGC zu untersuchen. Diese basieren auf dem Reportergen bpsA, welches zur Produktion des blauen Pigments Indigoidin führt. Ein Biosensorstamm zeigte die Produktion von Indigoidin. Um zu untersuchen, ob dies auf die Aktivität des BGC zurückzuführen ist, wurde ein Knockout-Vektor konstruiert. Außerdem wurden Überexpressionsvektoren basierend auf fünf regulatorischen Sequenzen erstellt. Die Einführung des Knockout-Vektors und der meisten Überexpressionsvektoren, mit Hilfe von Conjugation, schlug fehl. Die erzeugten rekombinanten Stämme einer Fermentation unterzogen. Die daraus hergestellten Extrakte wurden mittels Hochleistungsflüssigchromatographie analysiert. Eine Farbveränderung konnte in einem Stamm beobachtet werden. Ein Extrakt zeigte eine leichte Bioaktivität gegenüber zwei Testorganismen in einem Scheibendiffusionstest. Um zu identifizieren, welche Verbindung für die Bioaktivität verantwortlich ist, ob sie mit Region 2.34 oder einem anderen zuvor stillen BGC assoziiert werden kann und ob es sich möglicherweise um eine unbekannte Verbindung handelt, wären weitere Untersuchungen erforderlich.