تحويل التسلسل العشوائي والمقاومة لـ 5-فلورو يوريدين في إنزيمات الثيميديلات البشرية

إنزيم الثيميديلات (TS) يُحفز ميثلة dUMP إلى dTMP ويعتبر الهدف للعامل الكيميائي 5-فلورويوراسيل المستخدم على نطاق واسع. استخدمنا تحول التسلسل العشوائي لاستبدال 13 كودون داخل الموقع النشط للـ TS والحصول على متغيرات مقاومة لـ 5-فلوروديوكسي يوريدين (5-FdUR). تم اختيار المكتبة العشوائية الناتجة بناءً على قدرتها على تكملة سلالة الإشريكية القولونية المفقودة للـ TS، وأظهرت تحليل تسلسل الناجين أن هناك استبدالات متعددة مقبولة ضمن المنطقة المستهدفة. تم إجراء اختيار مستقل للمكتبة في وجود 5-FdUR، مما أدى إلى طيف أكثر محدودية من الطفرات. تم ملاحظة طفرة محددة واحدة، C199L، في أكثر من 46% من النسخ المقاومة لـ 5-FdUR. تم تنقية الطافر الثلاثي المقاوم لـ 5-FdUR، A197V/L198I/C199F، إلى نقاء ظاهر. تشير الدراسات الحركية مع الركيزة dUMP إلى أن هذا الطافر مشابه لنوع البرية من حيث قيم kcat وKm للـ dUMP والراكب المرافق CH2H4-folate. في المقابل، تظهر دراسات الربط التوازني مع المثبط، FdUMP، أن ثابت التفكك (Kd) لارتباط FdUMP في المجمع الثلاثي كان أعلى بمقدار 20 مرة من القيم التي تم الحصول عليها للإنزيم من النوع البري. هذا الطافر المقاوم لـ 5-FdUMP، أو غيره من الطافرات التي تم اختيارها بشكل مشابه، هو مرشح للاستخدام في العلاج الجيني لجعل الخلايا الطبيعية القابلة للإصابة مقاومة للتأثيرات السامة لـ 5-فلورويوراسيل المنتشر.