تقييم تأثيرات بروتوكولات المختبر على احتمالية اكتشاف الحمض النووي البيئي للأسماك العذبة المهددة بالانقراض

تعتمد فعالية ودقة الكشف باستخدام الحمض النووي البيئي (eDNA) على فهم التأثير الذي تتركه طرق المختبر مثل استخراج الحمض النووي واستراتيجيات PCR على احتمالية الكشف. من الناحية المثالية، يجب أن يؤدي اختيار طريقة العينة والاستخراج إلى زيادة إنتاج eDNA واحتمالية الكشف. قد تعوض تحديد الجهد المطلوب في الدراسة للوصول إلى احتمالية كشف مرضية (عبر زيادة تكرارات PCR أو مزيد من العينات) عن انخفاض إنتاج eDNA إذا كانت طريقة العينة والاستخراج لها مزايا أخرى لدراسة أو نوع أو نظام معين. قمت بتحليل تأثير ثلاث طرق مختلفة للعينة والاستخراج على إنتاج eDNA، واحتمالية الكشف، وتكرار PCR لاكتشاف سمكة المياه العذبة المهددة Macquaria australasica من عينات المياه. تم تقييم تأثير تركيز eDNA واستراتيجية PCR وحجم الأمبليكون المستهدف ومنطقتين محددتين: 12S (جين ميتوكوندري) و18S (جين نووي). كان لاختيار طريقة العينة والاستخراج واستراتيجية PCR، بدلاً من حجم الأمبليكون ومنطقة المؤشر، أكبر تأثير على احتمالية الكشف وتكرار PCR. تراوحت جهود تكرار PCR المطلوبة لتحقيق احتمالية كشف تبلغ 0.95 بين 2 إلى 6 تكرارات PCR حسب الطريقة المستخدمة في المختبر. نظرًا لأن جميع الطرق أنتجت eDNA الذي تم الكشف فيه عن M. australasica باستخدام ثلاثة أمبليكونات مستهدفة، يمكن تقليل الاختلافات في إنتاج eDNA واحتمالية الكشف بين الطرق الثلاثة عن طريق تحديد جهد تكرار PCR المناسب. يعد تقييم تأثير طرق العينة والاستخراج على احتمالية الكشف وتحديد بروتوكولات المختبر وتكرار PCR المطلوبة لتعظيم الكشف وتقليل الإيجابيات والسلبيات الكاذبة خطوة أولى مفيدة لدراسات شغور eDNA.