توليد DNA دائري مغلق من فيروس التهاب الكبد B باستخدام DNA فيروس البكتيريا المفردة M13 لوظائف صبغية صغيرة أصلية

الملخص: فيروس التهاب الكبد B (HBV) يتمثل DNA دائري مغلق (cccDNA) في شكل صبغيات صغيرة في نوى الكبد ويعمل كقالب نسخي للـ RNAs الفيروسية. يشكل تجمع cccDNA المستقر، الذي يتميز بعدد نسخ منخفض جداً، تحديات لدراسة خصائصه الجزيئية وتطوير العلاجات المستهدفة. لمحاكاة تسلسلات وهياكل cccDNA بشكل دقيق، طورنا طريقة جديدة باستخدام نظام قائم على فيروس M13 وديكسي ريبوزيم لإنتاج DNA المفرد الكامل (ssDNA) المتوافق مع كل من الشريحتين الإيجابية والسلبية لـ cccDNA. تتضمن هذه الطريقة تشكيل حلقة لـ ssDNA يليه إضافة DNA ليغاز T4، مما ينتج cccDNA. يسمح cccDNA الحلقي في المختبر، المكون من DNA مفرد مشتق من فيروس M13 (McccDNA)، بتشكيل صبغيات صغيرة في خلايا كبدية مُعدة مؤقتا، ويعيد تمثيل المراحل الأساسية من دورة حياة HBV، ويستجيب بفاعلية للعديد من الأدوية المضادة للفيروسات. بالإضافة إلى ذلك، أثبت أن McccDNA، لعدم احتوائه على تسلسلات خارجية، يجمع بشكل دقيق RNA الفيروسية الرئيسية وينظم النوكليوسومات بطريقة محددة تسلسليًا. علاوة على ذلك، يسمح نموذج McccDNA بحذف مستهدف للبروتينات الفيروسية، مما ينتج عنه فينوتيب فقدان الوظيفة المفيد لدراسات الصبغيات الصغيرة الإضافية. في الختام، يعيد McccDNA المولد من DNA المفرد لفيروس M13 تمثيل الخصائص الطبيعية لـ cccDNA من HBV ويعمل كنموذج أصلي لدراسة وظائف صبغيات cccDNA. الأهمية: لا يزال فيروس HBV يمثل عبئا كبيرا على الصحة العامة في جميع أنحاء العالم، حيث يعمل cccDNA كقالب نسخي لـ RNAs الفيروسية التي تحافظ على العدوى المستمرة. إن العدد المنخفض من نسخ cccDNA في النواة وغياب النماذج الحقيقية في المختبر تعيق تحقيقه وتطوير العلاجات. هنا، أسسنا نهج DNA مفرد مستمد من فيروس M13 لتوليد cccDNA من HBV بشكل فعال في المختبر. عند نقلها، تجمع جزيئات cccDNA في صبغيات صغيرة وقد ثبت أنها نشطة بيولوجياً، مما ينتج RNAs فيروسية أكثر دقة تعيد تمثيل النسخ المستمدة من العدوى مقارنةً بـ cccDNA المعدلة. كما يسمح النظام أيضاً بإحداث طفرات مستهدفة لدراسات فقدان الوظيفة بالإضافة إلى وضع علامات محددة المكان. توفر هذه النتائج رؤى حول تنظيم النوكليوسومات وخصائص النسخ الخاصة بصبغيات cccDNA من HBV، مما يقدم منصة أصلية لدراسة وظائف الصبغيات وتفاعلات المضيف والفيروس.