منصة دمج الحمض النووي متعددة نقاط الهبوط لهندسة خلايا الثدييات

تتطلب هندسة خطوط خلايا الثدييات التي تعبر بشكل مستقر عن العديد من الجينات الخارجية إدخالًا دقيقًا لكميات كبيرة من الحمض النووي غير المتجانس في مواقع جينومية ذُكرت بدقة، لكن الأساليب الحالية محدودة. لتسهيل هندسة خلايا CHO على نطاق واسع بشكل موثوق، حددنا 21 موقعًا جينوميًا جديدًا يدعم التعبير المستقر طويل الأمد للجينات الخارجية، ثم أنشأنا خطوط خلايا تحتوي على موقع واحد أو اثنين أو ثلاثة من مواقع إعادة التركيب "نقاط الهبوط" في مواقع مختارة. باستخدام إنزيم BxB1 الذي يعمل بكفاءة عالية مع علامات اختيار مختلفة في كل موقع، وجهنا الإدخال الذي يحدث بواسطة الإنزيم إلى المواقع المختارة، بما في ذلك استهداف الثلاثة مع حقن واحد. استخدمنا هذه الطريقة لدمج ما يصل إلى تسع نسخ من جسم مضاد وحيد النسيلة، تمثل حوالي 100 كيلوبايت من الحمض النووي غير المتجانس في 21 وحدة نسخ. نظرًا لأن الدمج تم استهدافه لمواقع تم التحقق منها مسبقًا، ظل تعبير البروتين المؤتلف مستقرًا لأسابيع، وأدت النسخ الإضافية من كاسيت الجسم المضاد في الحمولة المدمجة إلى زيادة خطية في تعبير الجسم المضاد. بشكل عام، تتيح هذه المنصة لدمج المواقع الخاصة بالنسخ المتعددة إدخال كميات كبيرة من الحمض النووي بشكل قابل للتحكم وقابل للتكرار في مواقع جينومية مستقرة، مما له تطبيقات واسعة في علم الأحياء الاصطناعية للثدييات، وإنتاج البروتينات المؤتلفة، والتصنيع الحيوي.