مسبار فلوروسنت استجابة ثيوريدوكسين الميتوكوندريا - تشغيل/إيقاف

قمنا بتخليق مسبار جديد، ميتو-ناف، لرؤية نشاط ثيوريدوكسين الميتوكوندريا (Trx) في الخلايا. يحدث تغيير فلوروسنت من إيقاف إلى تشغيل نتيجة لتحليل الرابطة ثنائية الكبريت الناتج عن تفاعل مع Trx، مما يؤدي إلى عملية حلقة جزيئية داخلية بواسطة الثيولات المحررة لإنتاج منتج فلوروسنت. من خلال قياس الفلورية عند 540 نانومتر، يمكن اكتشاف نشاط Trx عند تركيزات نانومولارية (تنخفض إلى 50 نانومتر) أقل بكثير من مستوياتها الفسيولوجية. تم إثبات تفضيل Trx لـ ميتو-ناف من خلال التجارب الفلورية والميكروسكوبية التحتية. كشفت التحليلات الحركية في المختبر لتحليل الرابطة ثنائية الكبريت أن ثابت السرعة من الدرجة الثانية لـ Trx هو (4.04 ± 0.26) × 10(3) (M s)(-1)، أسرع بنحو 5000 مرة من ذلك لـ GSH. كشفت تجارب التثبيط التي تشمل PX-12، وهو مثبط انتقائي لـ Trx، أيضًا أن الانبعاث من ميتو-ناف انخفض بشكل ملحوظ بطريقة تعتمد على جرعة PX-12، سواء في الخلايا الحية أو في مستخلصات بروتين الخلايا. تم دعم تفضيل Trx أيضًا من خلال ملاحظة أن شدة الفلورية لاستخراج كبد الجرذ انخفضت وفقًا لنقص Trx بواسطة الترسيب المناعي. بناءً على هذه النتائج، تم الاستنتاج بأن ميتو-ناف يتفاعل بشكل مفضل مع Trx، مقارنة بالثيولات البيولوجية الأخرى التي تحتوي على الأحماض الأمينية في المختبر وفي الجسم الحي.