تجديد ريبونوكيليز A من البروتين المختزل. عزل وتحديد الوسطاء والمعالجة بالتوازن

تم إعادة أكسدة RNase A المختزل ، وتم إعادة تشكيل الروابط ثنائية الكبريتيد التي تم تشكيلها بشكل غير صحيح إلى الروابط الأصلية بواسطة الجلوتاثيون المؤكسد والمختزل، كما تم وصفه في الورقة الأولى من هذه السلسلة. تم القبض على الوسطاء في تجديد الروابط ثنائية الكبريتيد دون أي تعديل كيميائي وتم فصلهم على عمود كربوكسيمثيل السليلوز عند pH 3.5 مع تدرج ملحي. تم الحصول على منحنيات الإزهار لـ RNase A المتجددة جزئيًا من عمود كربوكسيمثيل السليلوز عن طريق قياس الامتصاص عند 275 نانومتر وتحديد محتوى SH (لبقايا سيستين) واشتملت على 11 كسراً، G8، G7، G6، G5، G4، G3، G2، G1، G0، N، و F. تم عزل بعض هذه الكسور، وكانت أوزانها الجزيئية المقاسة متوافقة مع تلك لـ RNase A أحادي الجزيء. كان للكسرة F وزن جزيئي بين وزن أحادي الجزيء ووزن ثنائي الجزيء، لذلك لم يكن من الممكن تحديد هذه الكسرة. يمكن تمثيل مسار التجديد من حيث ردود فعل بسيطة، RNase A(-SH) + GSSG في حالة توازن أو تتكون من RNase A(-SSG) + GSH و RNase A(-SH-SSG) في حالة توازن RNase A(أكبر من S2) + GSH، مما أنتج 24 وسيطًا أحادي الجزيء (دون احتساب الأنواع المختزلة بالكامل والأصلية)، والتي اختلفت عن بعضها من حيث تكوينها من الأحماض الأمينية. تم تخصيص هذه الــ 24 وسيطًا، بالإضافة إلى البروتين المختزل بالكامل، للكسور G8--G0 (كما هو موضح في العمود الأخير من الجدول I)، بمساعدة بيانات من تحليل الأحماض الأمينية ومحتوى SH وموقع الإزهار على كروماتوغرام عمود كربوكسيمثيل السليلوز. نظرًا لأن تفاعل التجديد وصل بسرعة إلى حالة توازن مسبقة بين الوسطاء وRNase A المختزل بالكامل قبل خطوات تحديد المعدل، أي، أصبحت التركيزات النسبية للوسطاء وRNase A المختزل بالكامل ثابتة مع وقت التفاعل، فقد تم تقدير مجموعات بعض الوسطاء في الحالة التوازنية المسبقة من خلال ملاءمة المنحنى لنمط الإزهار من كروماتوغرام عمود كربوكسيمثيل السليلوز. تم حساب الثوابت التوازنية بين الوسطاء من سكانهم في التوازن المسبق. تم