البلازميدات لاستنساخ وتعبير شريطين مزدوجين كاملين من cDNAs تحت سيطرة محفز الجين المبكر أو المتأخر لـ SV40

وصف أوكاياما وبيرغ (1) مؤخرًا تقنية لاستنساخ cDNAs كامل الطول بكفاءة عالية. لقد قمنا بإنشاء متجهات تعبير حقيقية تتوافق مع هذه التقنية (ومع التقنيات الكلاسيكية) لاستنساخ cDNA. المتجهات مصممة بحيث تحتوي المستخلصات التي تم الحصول عليها على cDNAs في الاتجاه الصحيح بعد كتلة من التسلسل تتضمن إما محفز الجين المبكر أو المتأخر لـ SV40 مرتبطًا بزوج من مواقع الانشطار من جين بيتا-غلوبين من الأرانب. يتبع cDNA تسلسل يشفر موقع بولي أدينيل في SV40. لقد استخدمنا متجهاتنا لإنشاء مكتبة من RNA polyA(+) من قناة البيض للدجاج باستخدام تقنية أوكاياما وبيرغ. تحدث المستخلصات الخاصة بالألبومين البيضاوي في المكتبة عند التردد المتوقع ونسبة عالية تحتوي على نسخ كاملة من mRNA للألبومين البيضاوي. ومع ذلك، لم يتم الحصول على نتيجة مشابهة لمستخلصات الكون ألبيومين. عندما يتم إدخال المستخلصات إلى خلايا حقيقية من خلال ترسيب الكالسيوم الفوسفاتي أو اندماج البروتوبلاست، قد يتم الكشف عن تعبير الألبومين البيضاوي للدجاج أو الكون ألبيومين من خلال التألق المناعي غير المباشر. في الظروف المثلى (استخدام محفز SV40 المتأخر وخلايا COS 7)، يمكن الكشف عن بروتين الألبومين البيضاوي عندما يكون المستخلص الخاص بالألبومين البيضاوي موجودًا في 2% فقط من البروتوبلاست المستخدم في الاندماج. وهذا يقترح أن البنوك المستعمرة التي تم الحصول عليها باستخدام متجهاتنا يمكن فحصها في دفعات من 50 من خلال اندماج البروتوبلاست يليه بحث عن تعبير بروتين معين باستخدام التألق المناعي غير المباشر.