PixFRET، مكون إضافي لـ ImageJ لحساب FRET يمكنه استيعاب التغيرات في تسرب الطيف

يسمح نقل الطاقة الرنانة الفلورية (FRET) للمستخدم بالتحقيق في التفاعلات بين الشركاء الفلوريين. إحدى القضايا الحاسمة عند حساب الانبعاث المعزز FRET هي التصحيح لتسرب الطيف (SBTs)، الذي يتطلب حساب النسب بين الشدات في إعدادات FRET وفي إعدادات المانح أو المستقبل، عندما يكون المانح أو المستقبل موجودًا فقط. نظريًا، يجب أن تكون نسب SBT ثابتة. ومع ذلك، تجريبيًا، يمكن أن تختلف هذه النسب كدالة لشدّة الفلورسنت، ويفترض أن القيم الثابتة قد تعوق حساب FRET بدقة. أحد الأسباب المحتملة لمثل هذا التفاوت هو استخدام إعداد الميكروسكوب مع مضاعفات ضوئية مختلفة لقنوات المانح وFRET، وهو إعداد يسمح بالاستحواذ بسرعة أعلى على جزيئات فلورية ديناميكية جدًا في خلايا حية. هنا، نوضح أن التحيز الذي أدخله الاستجابة التفاضلية لمضختي الضوء يمكن التغلب عليه من خلال نمذجة بسيطة لنسب SBT كدالة لشدة الفلورسنت. قضية أخرى مهمة عند تنفيذ FRET هي تحديد موقع FRET داخل الخلية أو مجموعة من الخلايا. وبالتالي، قمنا بتطوير مكون إضافي مجاني متاح لـ ImageJ، يسمى PixFRET، الذي يسمح بتحديد بسيط وسريع لبارامترات SBT وعرض صور FRET المُنظمة. تم توضيح فائدة هذه النمذجة والمكون الإضافي من خلال دراسة FRET في نظام حيث يتم التعبير عن مستقبلين نوويين متفاعلين مميزين بـ ECFP وEYFP في خلايا حية.