Nuevas perspectivas sobre la extracción de ADN y la amplificación por PCR de ascomicetos minúsculos en el género Laboulbenia (Pezizomycotina, Laboulbeniales)

Resumen Los estudios moleculares de hongos dentro del orden Laboulbeniales (Ascomycota, Pezizomycotina) han sido obstaculizados durante años debido a su tamaño diminuto, la incapacidad para crecer en cultivos axénicos y la falta de protocolos de extracción de ADN fiables y rentables. En particular, el género Laboulbenia es conocido por tener bajo éxito en la extracción de ADN y la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esto se atribuye a la presencia de melanina, una molécula conocida por inhibir la PCR, en las células. Evaluamos la eficacia de un protocolo estándar de extracción de ADN basado en una sola célula al reducir a la mitad la cantidad recomendada de reactivos para disminuir el costo por extracción y añadir albúmina sérica bovina (BSA) durante el paso de amplificación por desplazamiento múltiple para revertir el efecto de la melanina. Se realizaron un total de 196 extracciones, de las cuales 111 fueron exitosas. Encontramos que reducir a la mitad los reactivos utilizados en el kit de extracción basada en una sola célula no afectó significativamente la probabilidad de extracción exitosa de ADN. Usar el protocolo reducido disminuye costos y el consumo de recursos. Además, no hubo diferencia significativa en la probabilidad de extraer ADN con éxito según se añadiera o no BSA, lo que sugiere que la cantidad de melanina presente en las células del talo no tiene un efecto inhibitorio importante en la PCR. Generamos 277 secuencias de cinco loci, pero la amplificación de la región del espaciador interno transcrito, la subunidad pequeña del ADN ribosómico mitocondrial y los genes que codifican proteínas sigue siendo un desafío. La probabilidad de extraer ADN con éxito de Laboulbeniales también fue impactada por los métodos de almacenamiento de muestras, siendo el material preservado en > 95% de etanol el que presentó tasas de éxito más altas en comparación con el material almacenado en 70% de etanol y el material seco. Enfatizamos la importancia de la correcta preservación del material y proponemos el diseño de cebadores específicos para Laboulbeniales para superar los problemas de desajustes de cebadores y contaminantes. Nuestras nuevas perspectivas se aplican no solo al género Laboulbenia; los Laboulbeniales en general están insuficientemente estudiados y la gran mayoría de las especies permanecen sin secuenciar. Nuevos y accesibles desarrollos moleculares beneficiarán el estudio de los Laboulbeniales, ayudando a dilucidar la verdadera diversidad y las relaciones evolutivas de estos peculiares microhongos.