Detección simple, sensible y visual de 12 patógenos respiratorios con el ensayo de un solo tubo RPA-CRISPR/Cas12a

Las infecciones respiratorias suponen una grave amenaza para la salud pública global, subrayando la urgente necesidad de herramientas de diagnóstico rápidas, precisas y a gran escala. En los últimos años, el sistema CRISPR/Cas (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas/asociadas a CRISPR), combinado con métodos de amplificación isoterma, ha tenido una amplia aplicación en pruebas de ácidos nucleicos (NAT). Sin embargo, lograr un sistema de reacción de un solo tubo que contenga todos los componentes necesarios es un desafío debido a los efectos competitivos entre la amplificación de polimerasa recombinante (RPA) y los reactivos de CRISPR/Cas. Además, para permitir la medicina de precisión, es esencial distinguir entre infecciones bacterianas y virales. Aquí, hemos desarrollado un nuevo método de NAT, denominado RPA-CRISPR/Cas12a en un solo tubo, que combina RPA con tecnología de diagnóstico molecular CRISPR, permitiendo la detección simultánea de 12 patógenos respiratorios comunes, incluyendo seis bacterias y seis virus. Las reacciones de RPA y CRISPR/Cas12a están separadas por parafina, proporcionando una plataforma independiente para que las reacciones de RPA generen productos de objetivo suficientes antes de mezclarse con el sistema CRISPR/Cas12a. Los resultados se pueden observar visualmente bajo luz azul LED. La sensibilidad del método RPA-CRISPR/Cas12a en un solo tubo es de 2.5 × 10.