Desarrollando un enfoque multicanal smFRET para disecar los mecanismos ribosomales

El ribosoma, una biomolécula de 2.6 megadalton que mide aproximadamente 20 nm de diámetro, coordina numerosos ligandos, factores y reguladores para traducir proteínas con alta fidelidad y rapidez. Comprender sus funciones complejas requiere observaciones multiperspectivas. Desarrollamos un método de transferencia de energía por resonancia de Förster de molécula única de doble-FRET (dual-smFRET), que permite la observación y correlación simultáneas de la dinámica del tRNA y las conformaciones del Factor de Elongación G (EF-G) en el mismo complejo, en una ventana de tiempo de 10 s. Al sincronizar cortinas láser y conjuntos de filtros motorizados, se capturan dos señales FRET en intervalos de 5 s consecutivos con un intervalo de tiempo de 50-100 ms. Observamos emisiones fluorescentes distintas de complejos ribosomales etiquetados con uno, dos y cuatro marcadores. A través de un análisis espectral completo y corrección, distinguimos y correlacionamos cambios conformacionales en dos partes del ribosoma, ofreciendo perspectivas adicionales sobre su coordinación y temporización durante la translocación. La versatilidad de nuestro conjunto, que permite hasta seis pares de FRET, sugiere aplicaciones más amplias en el estudio de biomoléculas grandes y diversos sistemas biológicos.