Medición precisa del contenido de G+C del ácido desoxirribonucleico mediante cromatografía líquida de alta resolución

La cromatografía líquida de alta resolución es una alternativa prometedora para determinar el contenido de G+C del ácido desoxirribonucleico (ADN) bacteriano. El método que evaluamos implica la degradación enzimática del ADN a nucleósidos mediante nucleasa PI y fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina, separación de los nucleósidos por cromatografía líquida de alta resolución y cálculo del contenido de G+C a partir de las proporciones aparentes de desoxiadenosina y timidina. Debido a que los nucleósidos se liberan del ADN a diferentes tasas, la degradación incompleta produce grandes errores en el contenido aparente de G+C. Para el ADN parcialmente purificado, las sales son una fuente importante de interferencia en la degradación. Sin embargo, cuando las sales se eliminan cuidadosamente, la preparación y degradación del ADN contribuyen con poco error a la determinación del contenido de G+C. Este método también requiere una selección cuidadosa de las condiciones cromatográficas para garantizar la separación de los nucleósidos principales de los nucleósidos de bases modificadas y un control preciso de las tasas de flujo. Ambas condiciones son alcanzables con equipos estándar y columnas de fase reversa C18. Entonces, el método es preciso y las desviaciones estándar relativas de las mediciones replicadas están cerca del 0.1%. También es rápido, y una única medición requiere aproximadamente 15 minutos. Requiere pequeñas cantidades de muestra y el contenido de G+C se puede determinar a partir del ADN aislado de una sola colonia bacteriana. No se ve afectado por la contaminación con ácido ribonucleico. Dado que este método proporciona una medición directa, también puede ser más preciso que los métodos indirectos, como los métodos de densidad de flotación y desnaturalización térmica. Además, para el ADN altamente purificado, se puede determinar el grado de modificación.