Die Krebsbehandlung ist nach wie vor einer der anspruchsvollsten Bereiche der biomedizinischen Forschung und hat angesichts der wachsenden Zahl von Patienten, die wirksame Therapien benötigen, eine erhebliche gesellschaftliche Relevanz. Über die konventionellen Behandlungsmethoden hinaus hat die Krebsforschung innovative therapeutische Strategien vorangetrieben, darunter Immuntherapien und genbasierte Ansätze. In diesem Zusammenhang haben sich Gentherapie und mRNA-Technologien als vielseitige Plattformen für die Entwicklung neuartiger Behandlungen herausgestellt. Die intrinsischen physikalisch-chemischen Eigenschaften von mRNA stellen jedoch erhebliche Herausforderungen für eine effiziente und gezielte Verabreichung dar, sodass der Einsatz spezieller Wirkstofffreisetzungssysteme wie polymerbasierter Träger erforderlich ist. PEGyliertes lineares Polyethylenimin (LPEI) stellt, wenn es mit Zielmolekülen weiter funktionalisiert wird, um LPEI-PEG-Tri-Konjugate zu bilden, ein vielversprechendes Trägersystem für die gezielte In-vivo-Verabreichung von Nukleinsäuren dar. Der Synthesevorgang und insbesondere die nachgeschaltete Reinigungsstrategie spielen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Qualität, Reproduzierbarkeit und Funktionsleistung dieser polymeren Konjugate. Das primäre Ziel dieser Studie war die Optimierung der Synthese und Reinigung von LPEI10kDa-PEG2k-basierten Tri-Konjugaten. Die Tri-Konjugat-Synthese umfasste die anfängliche Konjugation von LPEI (10 kDa) mit einem heterobifunktionellen PEG2k-Linker zur Bildung eines LPEI10kDa-PEG2k-OPSS-Bi-Konjugats, gefolgt von einer Reinigung mittels Kationenaustauschchromatographie und Entsalzung entweder durch Zentrifugalfiltration oder Dialyse. Das gereinigte Bi-Konjugat wurde anschließend mit Cystein zur Reaktion gebracht, um das entsprechende Tri-Konjugat zu erzeugen, welches erneut chromatographisch gereinigt und entweder durch Zentrifugalfiltration oder Dialyse entsalzt wurden. Ein zentraler Schwerpunkt dieser Arbeit war die Optimierung von Reinigungsstrategien für LPEI10kDa-basierte Bi- und Tri-Konjugate durch eine vergleichende Bewertung von Zentrifugalfiltration und Dialyse. Dieser Vergleich zeigte, dass die Dialyse hinsichtlich der Entsalzungseffizienz und der Gesamtausbeute überlegen war, während die Zentrifugalfiltration eine deutlich höhere Zeiteffizienz bot und zu höheren OPSS/CYS-zu-LPEI-Molverhältnissen führte. Zur Unterstützung dieser Optimierung wurde die LPEI-Quantifizierung unter Verwendung einer kupferbasierten Analyse systematisch hinsichtlich der Haltbarkeit der Reagenzien, der Analysen-Variabilität und des Polymer- oder Konjugatverlusts während der Reinigung bewertet. Die Haltbarkeit der Reagenzien wurde auf 41 Tage festgelegt. Die Analysen-Variabilität lag zwischen 2 und 18 % und sank bei allen Verdünnungen unter 7%, wenn die Reagenzienkonzentrationen 30 µg/ml überschritten. Dies deutet darauf hin, dass zur Verringerung der Variabilität der Kupfer-Analysen-Ergebnisse eine Standardkurve mit Verdünnungen über 30 μg/ml verwendet werden sollte. In Bezug auf den Konjugatverlust während der Reinigung führte eine höhere Verdünnung vor der Kationenaustauschchromatographie zu einem geringeren Ertragsverlust. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein einziger Zentrifugalfiltrationsschritt als Standardverfahren zur Entsalzung ausgewählt. Mit diesem Ansatz wurde eine ausreichende Salz Entfernung bei akzeptablem Ertrag und reduzierter Verarbeitungszeit im Vergleich zu einem Waschprotokoll mit fünf Zyklen erreicht, das etwa eine zusätzliche Stunde erforderte. Zusätzlich wurden im Rahmen der Charakterisierung und als erster Anwendungsversuch dynamische Lichtstreuungsmessungen mit pDNA- und mRNA-basierten Polyplexen aus reinem LPEI sowie dem synthetisierten Tri-Konjugat durchgeführt, um Partikelgröße und Homogenität zu vergleichen.
Akinalp Ismet Saglam (Thu,) studied this question.