Mutagénesis En Passant: Un Sistema de Recombinación Roja Sin Marcador de Dos Pasos

Los cromosomas artificiales bacterianos se utilizan para mantener y modificar grandes secuencias de diferentes orígenes en Escherichia coli. Además de la mutagénesis por transferencia basada en RecA, la recombinación Roja se utiliza comúnmente para la modificación de secuencias. Dado que las secuencias extranjeras, como los genes de resistencia a antibióticos, así como los sitios frt- o loxP, a menudo son indeseables en clones de BAC mutantes, desarrollamos una técnica basada en Roja que permite la generación sin cicatrices de mutaciones puntuales, deleciones e inserciones de secuencias más pequeñas y más grandes. El método utiliza una duplicación de secuencia que se inserta en la secuencia objetivo en el primer paso de recombinación y la excisión del marcador de selección por escisión in vivo de I-SceI y la segunda recombinación Roja. Para permitir una mutagénesis conveniente y altamente eficiente sin el uso de plásmidos adicionales, se creó la cepa de E. coli GS1783 con una expresión inducible de Red y I-SceI codificada en el cromosoma.