Un Enfoque Práctico para el Clonaje y Expresión de Receptores de Células T

Aunque el clonaje y la expresión de Receptores de Células T (TcRs) se han realizado durante casi dos décadas, estos procedimientos siguen siendo desafiantes. Por ejemplo, el uso de clones de células T que han experimentado una expansión limitada como material de partida para limitar la pérdida de TcRs interesantes debe sopesarse con la introducción de mutaciones debido al exceso de ciclos de PCR. Sin embargo, el interés reciente en el uso de TcRs específicos para la inmunoterapia del cáncer ha aumentado la demanda de métodos prácticos y robustos para clonar y expresar TcRs rápidamente. Han surgido dos tecnologías principales para el clonaje de TcR; el uso de un conjunto de cebadores que se anclan específicamente a todos los dominios variables de TcR conocidos y la amplificación 5'-RACE. Aquí presentamos un protocolo 5'-RACE mejorado que representa una forma rápida y confiable de identificar un TcR a partir de solo 10(5) células, haciendo que el clonaje de TcR sea factible sin conocimiento previo de la secuencia del dominio variable. Además, presentamos un procedimiento detallado para el subclonaje de cadenas TcRα y β en un sistema de expresión. Mostramos que un protocolo de clonaje basado en recombinación facilita la transferencia simple y rápida del transgen TcR a diferentes sistemas de expresión. El método integral presentado se puede llevar a cabo en cualquier laboratorio con equipo estándar y con una cantidad limitada de material de partida. Finalmente, ejemplificamos la sencillez y fiabilidad de nuestro procedimiento clonando y expresando varios TcRs específicos de MART-1 y demostrando su funcionalidad.