Proteínas fluorescentes verdes permutadas circularmente diseñadas para detectar Ca 2+

Para visualizar interacciones proteína-proteína dependientes de Ca(2+) en células vivas a través de lecturas de fluorescencia, utilizamos una proteína fluorescente verde permutada circularmente (cpGFP), en la cual las porciones amino y carboxilo habían sido intercambiadas y reconectadas por un espaciador corto entre los extremos originales. El cpGFP fue fusionado a calmodulina y su péptido objetivo, M13. La proteína quimérica, que hemos denominado "pericam", era fluorescente y sus propiedades espectrales cambiaban de manera reversible con la cantidad de Ca(2+), probablemente debido a la interacción entre calmodulina y M13 que conduce a una alteración del entorno que rodea al cromóforo. Se obtuvieron tres tipos de pericam al mutar varios aminoácidos adyacentes al cromóforo. De estos, "flash-pericam" se volvió más brillante con Ca(2+), mientras que "inverse-pericam" se atenuó. Por otro lado, "ratiometric-pericam" tenía una longitud de onda de excitación que cambiaba de forma dependiente de Ca(2+). Todos los pericams expresados en células HeLa fueron capaces de monitorear la dinámica de Ca(2+) libre, como las oscilaciones de Ca(2+) en el citosol y el núcleo. La imagenología de Ca(2+) utilizando microscopía de escaneo de línea confocal de alta velocidad y un flash-pericam permitió detectar la propagación libre de iones Ca(2+) a través de la envoltura nuclear. Luego, las concentraciones de Ca(2+) libre en el núcleo y las mitocondrias se midieron simultáneamente utilizando ratiometric-pericams con señales de localización apropiadas, revelando que los transitorios de Ca(2+) extra-mitocondrial causaban cambios rápidos en la concentración de Ca(2+) mitocondrial. Finalmente, se hizo un "split-pericam" eliminando el conector en el flash-pericam. La interacción dependiente de Ca(2+) entre calmodulina y M13 en células HeLa fue monitoreada por la asociación de las dos mitades de la GFP, ninguna de las cuales era fluorescente por sí misma.