Una plataforma de reportero celular basada en TLR altamente sensible para la detección específica de ligandos bacterianos de TLR

Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores primarios de reconocimiento de patrones (PRR), que reconocen componentes microbianos conservados. Desempeñan roles importantes en la inmunidad innata, pero también en la iniciación de respuestas inmunitarias adaptativas. Las impurezas que contienen ligandos de TLR son un problema frecuente en la investigación, pero también para la producción de terapéuticos, ya que los ligandos de TLR pueden ejercer fuertes propiedades inmunomodulatorias incluso en cantidades mínimas. En consecuencia, existe la necesidad de herramientas sensibles para detectar ligandos de TLR con alta sensibilidad y especificidad. Aquí describimos el desarrollo de una plataforma basada en una línea celular Jurkat JE6-1 reportera NF-κB::eGFP altamente sensible para la detección de ligandos de TLR. Se implementó la expresión ectópica de TLR y sus correceptores, así como la eliminación mediada por CRISPR/Cas9 de TLR expresados endógenamente, para generar líneas celulares reporteras que expresan selectivamente complejos funcionales de TLR2/1, TLR2/6, TLR4 o TLR5 en humanos. Utilizando agonistas bien definidos para los respectivos complejos de TLR, pudimos demostrar la alta especificidad y sensibilidad de las líneas reporteras individuales. El límite de detección para LPS fue inferior a 1 pg/mL y los ligandos para TLR2/1 (Pam3CSK4), TLR2/6 (Fsl-1) y TLR5 (flagelina) se detectaron a concentraciones tan bajas como 1.0 ng/mL, 0.2 ng/mL y 10 pg/mL, respectivamente. Demostramos que las células reporteras de TLR JE6-1 tienen la utilidad de caracterizar diferentes ligandos de TLR disponibles comercialmente, así como muestras más complejas como proteínas expresadas bacterianamente o extractos de alérgenos. Las impurezas en las preparaciones de compuestos microbianos, así como la falta de especificidad de los sistemas de detección, pueden llevar a resultados erróneos y actualmente no existe consenso respecto a la implicación de los TLR en el reconocimiento de varias moléculas con funciones inmunoestimulantes propuestas. Este sistema reportero representa una herramienta altamente adecuada para la definición de los requisitos estructurales de los agonistas de complejos de TLR distintos.