Secuenciación de amplicones de alto rendimiento del gen completo del ARN ribosómico 16S con resolución de un solo nucleótido

La amplificación PCR dirigida y la secuenciación de alto rendimiento (secuenciación de amplicones) de fragmentos del gen del ARN ribosómico 16S se utiliza ampliamente para perfilar comunidades microbianas. Nuevas tecnologías de secuenciación de lectura larga pueden secuenciar el gen completo del ARN ribosómico 16S, pero las tasas de error más altas han limitado su atractivo cuando la precisión es importante. Aquí presentamos una metodología de secuenciación de amplicones de alto rendimiento basada en la secuenciación de consenso circular de PacBio y el método de inferencia de muestras DADA2 que mide el gen completo del ARN ribosómico 16S con resolución de un solo nucleótido y una tasa de error casi cero. En dos comunidades artificiales de composición conocida, nuestro método recuperó el complemento completo de variantes de secuencia 16S de longitud completa de los miembros de la comunidad esperada sin errores residuales. Las abundancias medidas de variantes de secuencia intra-genómica estaban en las proporciones integrales esperadas de las variantes alélicas genuinas dentro de un genoma. Las secuencias del gen 16S de longitud completa recuperadas por nuestro enfoque permitieron clasificar correctamente las cepas de Escherichia coli en los clados de sub-especies O157:H7 y K12. En muestras fecales humanas, nuestro método mostró una fuerte replicación técnica y fue capaz de recuperar el complemento completo de alelos del ARN ribosómico 16S en varias cepas de E. coli. Es probable que haya muchas aplicaciones más allá del perfilado microbiano para las cuales la secuenciación de amplicones de alto rendimiento de genes completos con resolución de un solo nucleótido será útil.