Análisis bioquímico de una enzima ciclocromo P450 multifuncional (CYP51) requerida para la síntesis de triterpenos antimicrobianos en plantas

Los miembros de la superfamilia de los citocromos P450 (P450s) catalizan una gran variedad de reacciones de oxidación en microbios y organismos superiores. La mayoría de las familias de P450 son muy divergentes, pero en contraste, la familia de citocromos P450 14α-esteroides desmetilasa (CYP51) es una de las más antiguas y conservadas, catalizando reacciones de desmetilación de esteroides 14α requeridas para la síntesis esencial de esteroides en los reinos fúngico, animal y vegetal. La avena (Avena spp.) produce compuestos antimicrobianos, avenacinas, que proporcionan protección contra enfermedades. Las avenacinas se sintetizan a partir del triterpeno simple, β-amirina. Anteriormente, identificamos un gen que codifica un miembro de la familia CYP51 de citocromos P450, AsCyp51H10 (también conocido como Saponin-deficiente 2, Sad2), que es requerido para la síntesis de avenacina en una búsqueda hacia adelante para mutantes de avenacina-deficientes de avena. Los mutantes sad2 acumulan β-amirina, lo que sugiere que están bloqueados temprano en la vía. Aquí, utilizando un sistema de expresión temporal en plantas, mostramos que AsCYP51H10 es un P450 multifuncional capaz de modificar ambos anillos C y D del andamiaje triterpeno pentacíclico para dar 12,13β-epóxido-3β,16β-dihidroxioleano (12,13β-epóxido-16β-hidroxibeta-amirina). Los experimentos de modelado molecular y acoplamiento indican que la hidroxilación de C16 es probable que preceda la epoxidación de C12,13. Nuestro modelado computacional, en combinación con el análisis de un conjunto de mutantes sad2, proporciona información sobre el comportamiento catalítico inusual de AsCYP51H10 y sus mutantes del sitio activo. Los bioensayos fúngicos muestran que el grupo epóxido C12,13 es un determinante importante de la actividad antifúngica. En consecuencia, la enzima AsCYP51H10 de la avena ha sido reclutada del metabolismo primario y ha adquirido una función diferente en comparación con otros miembros caracterizados de la familia CYP51 de plantas--como una hidroxilasa estereoespecífica y regioespecífica multifuncional en el metabolismo especializado de las plantas.