Detección de Molécula Única de Secuencias de Ácidos Nucleicos Específicos en ADN Genómico No Amplificado

Se describe una nueva técnica para la detección rápida de secuencias específicas de ácidos nucleicos en muestras de ADN no amplificadas. El método consiste en utilizar dos sondas de ácidos nucleicos complementarias a diferentes sitios en una secuencia de ADN objetivo. Las dos sondas están etiquetadas cada una con diferentes colorantes fluorescentes. Cuando se mezclan con una muestra que contiene el ADN objetivo, las dos sondas hibridan a sus respectivos sitios de unión en la misma molécula de ADN objetivo. La muestra se analiza luego mediante un sistema de fluorescencia ultrasensible basado en láser capaz de detectar moléculas fluorescentes individuales en dos canales de longitud de onda diferentes simultáneamente. Dado que las sondas están unidas a la misma molécula de ADN objetivo, sus señales aparecen simultáneamente. Así, la detección coincidente de ambos colorantes proporciona la especificidad necesaria para detectar una molécula de ADN objetivo de copia única no amplificada en un ensayo homogéneo. Si el objetivo no está presente, solo se observarán eventos no correlacionados provenientes de sondas libres en cualquiera de los canales. Se detectó ADN de fago lambda en un fondo de ADN genómico de salmón como una señal coincidente de dos colorantes a una concentración relativa de una molécula de lambda por genoma de salmón. En una muestra de control, la escisión del ADN de lambda entre los dos sitios de unión de sondas eliminó las señales coincidentes. En un segundo experimento, se detectó un transgén de copia única en maíz. Se discuten los parámetros de detección y posibles aplicaciones futuras en el análisis genético.