El papel de la cápside del virus adenoasociado en la transferencia génica

El virus adenoasociado (AAV) es uno de los vectores virales de transferencia génica más prometedores, que ha demostrado efectos de expresión génica a largo plazo y corrección de enfermedades con baja toxicidad en modelos animales, y es bien tolerado en ensayos clínicos en humanos. La superficie de la cápside del AAV es un componente esencial que está involucrado en la unión celular, internalización y tráfico dentro de la célula objetivo. Antes de desarrollar una estrategia de terapia génica que utilice AAV, se debe considerar cuidadosamente el serotipo, ya que cada cápside exhibe un tropismo tisular único y una eficiencia de transducción. Se han llevado a cabo varios enfoques en un esfuerzo por dirigir los vectores de AAV a tipos celulares específicos, incluyendo el uso de serotipos naturales que dirigen un receptor celular deseado, la producción de vectores seudo-tipo, y la ingeniería de cápsides de AAV quiméricas y mosaico. Estas modificaciones de cápsides se están incorporando en métodos de producción y purificación de vectores que permiten escalar el proceso de fabricación para apoyar ensayos clínicos en humanos. Aquí se presentan protocolos para la producción a pequeña y gran escala de AAV, así como ensayos para caracterizar el producto final del vector. Las estructuras de AAV2, AAV4 y AAV5 han sido resueltas mediante cristalografía de rayos X o microscopía electrónica criogénica (cryo-EM), y proporcionan una base para el diseño racional de vectores en el desarrollo de cápsides personalizadas para la dirección específica de vectores de AAV. Se ha demostrado que la cápside del AAV es notablemente estable, lo que es una característica deseable para un vector de terapia génica; sin embargo, recientemente se ha mostrado que los serotipos de AAV exhiben una susceptibilidad diferencial a proteasas. El patrón de fragmentación de la cápside cuando se expone a varias proteasas, así como la susceptibilidad de los serotipos a una serie de proteasas, proporciona una huella dactilar única para cada serotipo que puede ser utilizada para la validación de identidad de la cápside. Además de la identificación del serotipo, la susceptibilidad a proteasas también puede ser utilizada para estudiar cambios estructurales dinámicos que deben ocurrir para que la cápside del AAV realice sus diversas funciones durante el ciclo de vida del virus. El uso de proteasas para estudios estructurales en solución complementa los estudios estructurales cristalinos del virus. Aquí se proporciona un protocolo genérico basado en proteólisis para la identificación del serotipo de AAV.