Desarrollo de un nuevo sistema de transformación de hospedador cuádruple auxotrófico mediante la interrupción del gen argB utilizando el gen adeA y aprovechando la auxotrofía de adenina en Aspergillus oryzae

Anteriormente diseñamos un sistema de hospedador-vector auxotrófico triple en Aspergillus oryzae al aislar mutantes auxotróficos de adenina de color rojo tras la mutagénesis por UV de un hospedador auxotrófico doble (niaD-sC-). En el presente estudio se realizó un esfuerzo por aprovechar este sistema y construir un nuevo hospedador cuádruple auxotrófico interrumpiendo el gen argB involucrado en la biosíntesis de arginina. El casete de interrupción del gen argB fue generado mediante fusión PCR, que requirió solo dos pasos de PCR para insertar el marcador seleccionable, adeA, en el gen objetivo argB. El fragmento de ADN quimérico fue transformado en la cepa auxotrófica triple (niaD-sC-adeA-) y los disruptantes de argB se obtuvieron con una alta tasa de eficacia (aproximadamente 40%). Los disruptantes de argB fueron caracterizados por un color normal de colonia y la reversión de la auxotrofía de arginina mediante la introducción del gen argB de tipo salvaje. Posteriormente, se aislaron cepas auxotróficas cuádruples (niaD-sC-DeltaargB adeA- o niaD-sC-DeltaargB adeB-) tras la mutagénesis por UV de la cepa auxotrófica triple (niaD-sC-DeltaargB) seguida de la selección de colonias de color rojo por auxotrofía de adenina. Los resultados obtenidos mostraron que el gen adeA sirvió como un marcador de selección eficiente en el desarrollo de un nuevo sistema hospedador-vector con auxotrofía cuádruple en A. oryzae, proporcionando así una herramienta poderosa para criar múltiples mutantes auxotróficos de un deuteromiceto donde el cruce sexual es imposible.