Topología de membrana de un mutante sin cisteína de la P-glicoproteína humana

Se construyó una P-glicoproteína humana sin residuos de cisteína mediante mutagénesis dirigida al sitio para estudiar su topología. Se transfirió el ADNc de la P-glicoproteína humana-A52 en el que los codones para las cisteínas 137, 431, 717, 956, 1074, 1125, 1227, 1288 y 1304 se cambiaron a Ala, en células NIH 3T3 y se analizó en relación a su capacidad para conferir resistencia a varios fármacos. La P-glicoproteína-A52 sin cisteínas retuvo la capacidad de conferir resistencia a vinblastina, colchicina, doxorrubicina y actinomicina D con solo una pequeña disminución en eficiencia en relación con la enzima tipo salvaje. Luego se reintrodujeron residuos de cisteína en bucles extracelulares o citoplasmáticos predichos de la P-glicoproteína-A52 sin cisteínas, y se determinó la topología de la proteína utilizando reactivos específicos de tiol permeantes e impermeantes a la membrana. Se encontró que 8 de 15 residuos de cisteína introducidos en P-glicoproteína-A52 podían ser biotinilados, cuando las células que expresaban la P-glicoproteína mutante se incubaron con biotina maleimida permeante a la membrana. La biotinilación de un residuo de cisteína colocado en bucles extracelulares predichos entre el segmento transmembrana (TM) 5 y TM6, TM7 y TM8, o TM11 y TM12 fue bloqueada por el tratamiento previo de las células con un maleimida impermeante a la membrana, sugiriendo que estos residuos tienen una ubicación extracelular. Por el contrario, la biotinilación de residuos de cisteína ubicados en los bucles citoplasmáticos predichos entre TM2 y TM3, TM4 y TM5, TM8 y TM9, o TM10 y TM11 no fue bloqueada por el tratamiento previo con maleimida impermeante a la membrana, sugiriendo que estos residuos estaban en el citoplasma. Estos resultados son consistentes con el modelo de la P-glicoproteína, que predice seis segmentos transmembrana en cada una de las dos mitades homólogas de la molécula.