La interacción de la actina monomérica con dos sitios de unión en la actobindina de Acanthamoeba

Se ha demostrado previamente que la actobindina es un polipéptido de 88 residuos (Mr 9761) con un repetido interno en tándem de 33-34 aminoácidos. Los experimentos de equilibrio de sedimentación han confirmado este Mr para la actobindina nativa. La actobindina marcada con pireneglicolaldehído tuvo un Mr similar según el análisis de equilibrio de sedimentación y se vinculó a la actina de una manera cualitativamente similar a la actobindina no modificada, según lo determinado por el análisis electroforético en gel de los productos cruzados covalentemente. La estequiometría de la interacción actina-actobindina se determinó a partir del cambio en el Mr aparente de la actobindina marcada con pireno-glicolaldehído en presencia de actina, como se determinó al escanear la celda de ultracentrifugación en una longitud de onda que detectaba únicamente la proteína marcada. Estos datos fueron consistentes con la formación de un complejo que contenía dos moléculas de actina y una de actobindina. El KD general que describe la unión de la primera actina a cualquiera de los dos sitios en la actobindina fue de 3.3 microM. La constante de unión para la segunda actina sugirió cooperatividad negativa o desigualdad de los dos sitios de unión de actina. Se obtuvieron constantes de unión similares mediante el análisis de la mejora de fluorescencia que ocurrió cuando la actobindina se unió a actina marcada con pireno iodoacetamida o 4-(N-iodoacetoxi-etilo-N-metilo)-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole. Los experimentos de entrecruzamiento con 1-etilo-3-(3-dimetilaminopropilo)-carbodiimida y N-hidroxi-sulfosuccinimida coincidieron cualitativamente con las predicciones realizadas a partir de un modelo de dos sitios de unión. Además, tanto los experimentos de fluorescencia como los de entrecruzamiento sugirieron que la interacción de las dos moléculas de actina puede contribuir a la estabilidad del complejo heterotrimérico.