Cuantificación y Optimización de la Nanoscopía de Cambio de Molécula Única a Altas Velocidades

La nanoscopía de cambio de molécula única supera el límite de difracción de la luz al cambiar estocásticamente las moléculas fluorescentes únicas encendidas y apagadas, y luego localizar sus posiciones individualmente. Los avances recientes en esta técnica han acelerado enormemente la velocidad de adquisición de datos y mejorado la resolución temporal de la imagen de superresolución. Sin embargo, no se ha cuantificado si este aumento de velocidad viene a costa de comprometer la calidad de la imagen. La resolución espacial y temporal depende de muchos factores, entre los cuales la intensidad del láser y la velocidad de la cámara son los dos parámetros más críticos. Aquí comparamos cuantitativamente la calidad de imagen lograda al capturar imágenes de microtúbulos etiquetados con Alexa Fluor 647 en un rango ampliado de intensidades de láser y velocidades de cámara utilizando tres criterios: precisión de localización, densidad de moléculas localizadas y resolución de imágenes reconstruidas basadas en la Correlación de Anillo de Fourier. Encontramos que, con parámetros optimizados, la nanoscopía de cambio de molécula única a altas velocidades puede lograr la misma calidad de imagen que la imagen a velocidades convencionales en un período de tiempo de 5 a 25 veces más corto. Además, medimos la cinética de fotoswichting de Alexa Fluor 647 a partir de experimentos de molécula única y, basándonos en estos datos cinéticos, desarrollamos algoritmos para simular imágenes de nanoscopía de cambio de molécula única. Utilizamos esta herramienta de software para demostrar cómo la intensidad del láser y la velocidad de la cámara afectan la densidad de fluoróforos activos e influyen en la resolución alcanzable. Nuestro estudio proporciona pautas para elegir intensidades de láser adecuadas para la imagen de Alexa Fluor 647 a diferentes velocidades y un protocolo de cuantificación para futuras evaluaciones de otras sondas y parámetros de imagen.