Fresado CryoFIB de grandes muestras de tejido para tomografía crioelectrónica

La tomografía crioelectrónica (cryoET) es una herramienta poderosa para explorar la estructura molecular de organismos grandes. Sin embargo, los desafíos técnicos aún limitan las aplicaciones de cryoET en muestras grandes. En particular, la localización y el corte de objetos de interés de una muestra de tejido grande son pasos difíciles. En este estudio, informamos una estrategia de adelgazamiento de muestras y un flujo de trabajo para muestras de tejido basado en el fresado con haz de iones enfocado por criogenia (cryoFIB). Este flujo de trabajo proporciona una solución completa para aislar objetos de interés comenzando desde una muestra de tejido del tamaño de un milímetro y terminando con láminas de cientos de nanómetros de grosor. El flujo de trabajo implica la fijación de la muestra, pre-seccionado, una estrategia de fresado en dos pasos, y la localización del objeto de interés utilizando imagen secundaria electrónica celular (CSEI). La estrategia de fresado consiste en dos pasos, un paso de fresado grueso para mejorar la eficiencia de fresado, seguido de un paso de fresado fino. El fresado en dos pasos crea una estructura de surco-crestas con una capa conductora adicional de Pt para reducir el problema de carga inducida por el haz. CSEI se destaca en el flujo de trabajo, que proporciona localización sobre la marcha durante el fresado cryoFIB. Se realizaron pruebas del flujo de trabajo completo para demostrar la alta eficiencia y alta viabilidad del método propuesto.