Simplificando la genotipificación de mutantes a partir de edición genómica con un índice iGenotype basado en qPCR paralelo

La edición genética dirigida es una herramienta poderosa en estudios de genética reversa de la función génica en muchos aspectos de procesos biológicos y patológicos. El sistema CRISPR/Cas o nucleasas endógenas ingenierizadas como ZFNs y TALENs son las herramientas de edición genética más utilizadas que se introducen en células o huevos fertilizados para generar rupturas de doble cadena de ADN dentro de la región objetivo, desencadenando la reparación celular de ADN a través de recombinación homóloga o unión de extremos no homóloga (NHEJ). La reparación de ADN a través del mecanismo NHEJ suele ser propensa a errores, lo que conduce a mutaciones puntuales o indels (inserciones y deleciones) dentro de la región objetivo. Algunas de las mutaciones en embriones son transmisibles a la línea germinal, proporcionando así una forma efectiva de generar organismos modelo con mutaciones génicas dirigidas. Sin embargo, las mutaciones puntuales y los indels cortos son difíciles de genotipificar de manera efectiva, a menudo requiriendo secuenciación de ADN costosa y que consume mucho tiempo para obtener resultados fiables. Aquí, desarrollamos un ensayo de qPCR paralelo en combinación con un índice iGenotype para permitir una genotipificación simple y fiable. Los índices iGenotype asociados al genotipo convergieron en tres valores constantes específicos del genotipo (1, 0, -1) independientemente de los primers específicos de alelos utilizados en los ensayos de qPCR paralelos o las mutaciones génicas en un amplio rango de concentraciones de plantillas de PCR, resultando así en claros cortes específicos de genotipo, establecidos mediante análisis estadísticos, para la identificación del genotipo. Mientras establecimos un ensayo de genotipificación en el modelo de Xenopus tropicalis, el enfoque debería ser aplicable a la genotipificación de cualquier organismo o células y puede ser potencialmente utilizado para la genotipificación automatizada a gran escala.