Las sondas de ADN con ligando del surco menor en 3' aumentan la especificidad de secuencia a temperaturas de extensión de PCR

Las sondas de ADN con grupos conjugados de unión al surco menor (minor groove binder, MGB) forman dúplex extremadamente estables con dianas de ADN monocatenario, lo que permite utilizar sondas más cortas para ensayos basados en hibridación. En este artículo, se exploró la especificidad de secuencia de las sondas 3'-MGB. En comparación con el ADN no modificado, las sondas MGB presentaron una temperatura de fusión (T(m)) más alta y una mayor especificidad, especialmente cuando había un desapareamiento en la región MGB del dúplex. Para aprovechar estas propiedades, se prepararon e investigaron sondas MGB fluorogénicas en el ensayo de PCR con 5'-nucleasa (ensayo de PCR en tiempo real, ensayo TaqMan). Una sonda MGB de 12mer tuvo la misma T(m)(65 degrees C) que una sonda de 27mer sin MGB. Las sondas MGB fluorogénicas fueron más específicas para desapareamientos de una sola base y la extinción de la fluorescencia fue más eficiente, proporcionando una mayor sensibilidad. Los dúplex ricos en A/T se estabilizaron más que los dúplex ricos en G/C, nivelando así la T(m) de la sonda y simplificando el diseño. En resumen, las sondas MGB fueron más específicas de secuencia que las sondas de ADN estándar, especialmente para desapareamientos de una sola base a temperaturas elevadas de hibridación.