Activación de la acetil-CoA carboxilasa. Purificación y propiedades de una fosfatasa dependiente de Mn2+.

La acetil-CoA carboxilasa fue aislada del hígado de rata mediante precipitación con glicol polietileno y cromatografía de afinidad con avidina. La electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato del enzima da una banda de proteína (Mr 250,000). El análisis de fosfato de la carboxilasa mostró la presencia de 8.3 mol de fosfato/mol de subunidad (Mr 250,000). La carboxilasa purificada tiene baja actividad en ausencia de citrato (actividad específica = 0.3 unidades/mg). Sin embargo, la adición de 10 mM de citrato activa la carboxilasa 10 veces, con una activación media observada a 2 mM de citrato, muy por encima del nivel fisiológico de citrato. Usando esta carboxilasa como sustrato, hemos aislado del hígado de rata una proteína que activa la enzima aproximadamente 10 veces. Esta proteína ha sido purificada hasta casi homogeneidad (Mr 90,000). La incubación de esta proteína con acetil-CoA carboxilasa marcada con 32P resulta en una activación dependiente del tiempo de la carboxilasa con la liberación concomitante de 32Pi, lo que indica que esta proteína es una fosfoproteína fosfatasa. Tanto la activación como la de fosforilación dependen de Mn2+, pero no de citrato. Esta fosfatasa no hidroliza p-nitrofenil fosfato, pero muestra alta afinidad por la acetil-CoA carboxilasa (Km = 0.2 microM) en comparación con su acción sobre la fosforilasa a (Km = 5.5 microM) y fosfohistona (Km = 20 microM). La acetil-CoA carboxilasa activada fue aislada tras la de fosforilación por la fosfatasa. Tales preparaciones contienen alrededor de 5 mol de fosfato/mol de subunidad y tienen actividades específicas de 2.6-3.0 unidades/mg en ausencia de citrato. Estas actividades son comparables a las de la carboxilasa fosforilada en presencia de 10 mM de citrato. Así, la de fosforilación por la fosfatasa dependiente de Mn2+ hace que la carboxilasa sea independiente del citrato, en comparación con la forma fosforilada, que es dependiente del citrato. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de una preparación de acetil-CoA carboxilasa animal que tiene una actividad catalítica sustancial independiente del citrato.