Microscopía de fluorescencia por reflexión interna total por escaneo bajo excitación de un fotos y de dos fotones: formación de imágenes

Proponemos un nuevo tipo de microscopía de fluorescencia por reflexión interna total (TIRFM) llamada TIRFM de escaneo (STIRFM) que utiliza una iluminación de haz anular enfocado y un objetivo de alta apertura numérica (NA = 1.65). El campo evanescente producido por el STIRFM se enfoca lateralmente, produciendo un pequeño volumen de excitación que puede inducir un efecto no lineal como la absorción de dos fotones. Imágenes experimentales de nanocristales de puntos cuánticos de CdSe y microesferas dopadas con Rodamina 6G muestran que se logran buenas resoluciones laterales y axiales con la configuración actual. La simulación teórica del punto focal producido en la geometría del STIRFM muestra que el campo evanescente enfocado se divide en dos picos debido al efecto de despolarización de un objetivo de alta apertura numérica. Sin embargo, el análisis de la función de dispersión puntual de los casos de excitación de un fotón y de dos fotones muestra que la detección del efecto de división del enfoque depende del tamaño del orificio de detección. Se investiga teóricamente y se confirma experimentalmente el efecto del tamaño del orificio en la formación de imágenes con las imágenes de los nanocristales.