Detección directa del estado super-relajado de la miosina y del motivo de cabezas interactivas en solución

Resumen Hemos utilizado la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia temporalmente resuelta (TR-FRET) para detectar el motivo de cabezas interactivas (IHM) de la miosina cardiaca β en solución. Se ha observado evidencia del IHM a través de varias técnicas estructurales, y se ha propuesto que es la base estructural del estado super-relajado (SRX), un estado de baja ATPasa de la miosina que se ha observado bioquímicamente en fibras musculares desnudas utilizando ATP fluorescente. Se ha propuesto que la disrupción de este estado, ya sea por mutación o modificación química, es una de las principales causas de enfermedad cardíaca, por lo que se están desarrollando fármacos para estabilizarlo. El objetivo del presente estudio es determinar de manera directa y cuantitativa la correlación entre las fracciones medidas de miosina en el estado IHM y el estado SRX bajo las mismas condiciones en solución. Utilizamos TR-FRET para medir la distancia entre las dos cabezas de la miosina cardiaca bovina, y encontramos que hay dos poblaciones distintas, una de las cuales es observable por FRET a una distancia central de 2.0 nm, y la otra no es detectada, lo que implica una distancia mayor a 4 nm. En las mismas condiciones, también medimos la fracción de cabezas en el estado SRX utilizando nucleótidos fluorescentes y cinética de flujo detenido. Encontramos que, en ausencia de entrecruzamiento, la población de SRX superó a la de IHM. En particular, el efecto estabilizador de mavacamten fue mucho mayor sobre el SRX (aumento del 55%) que sobre el IHM (aumento del 4%). Concluimos que los estados SRX e IHM están relacionados, pero no son idénticos.