Nuevo soporte bifuncional reactivo a epóxido/tiol para inmovilizar proteínas que contienen tiol mediante química de epóxido

En este manuscrito, presentamos un nuevo soporte bifuncional que contiene grupos epóxido y reactivos a tiol para su uso en la inmovilización de proteínas. En un primer paso, las proteínas se inmovilizan de forma reversible mediante la reacción de sus grupos tiol con los grupos reactivos a tiol del soporte bajo condiciones experimentales suaves (pH 7.0, 24 grados C). Luego, los epóxidos restantes del soporte pueden formar enlaces irreversibles con grupos nucleofílicos de superficie de la proteína ya inmovilizada de manera rápida. La derivatización parcial de EP-Sepabeads (una matriz comercial que contiene 120 micromoles de grupos epóxido/g de soporte seco) fue optimizada, utilizando ditiotreitol (DTT) como agente tiolante. Se logró una tiolación parcial del soporte proporcional a la concentración de DTT utilizado (3, 8 y 15 micromoles de grupos SH/g de soporte húmedo). El contenido restante de epóxido después del tratamiento de tiolación fue alto (por ejemplo, casi el 70% para el mayor grado de tiolación). Se obtuvieron altos rendimientos de inmovilización para las tres enzimas modelo seleccionadas (60% para la acilasa de penicilina G, 65% y 100% para K. lactis y E. coli beta-galactosidasa, respectivamente). En todos los casos, no se encontró una inmovilización significativa en un soporte epóxido no modificado, demostrando así que el primer paso de unión se lleva a cabo a través de reacciones de intercambio tiol-disulfuro. En el caso del soporte bifuncional, se mostró la formación progresiva de uniones enzima-soporte que involucran los grupos epóxido mediante la unión covalente irreversible de las proteínas en el soporte. La promoción de esta inmovilización covalente multipunto requirió largos períodos de incubación a pH básicos.