फ्लोरोसेंट cAMP Difference Detector In Situ का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में रियल-टाइम cAMP डायनेमिक्स

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) एक नया बायोसेंसर है जो जीवित कोशिकाओं में cAMP के स्तर के निरंतर मापन की अनुमति देता है। यह बायोसेंसर Epac2 के हिंज क्षेत्र से जुड़े एक सर्कुलरली परम्यूटेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन से बनाया गया है। यह एक सिंगल फ्लोरोफोर बायोसेंसर बनाता है जो cAMP के बाइंडिंग पर बढ़ा हुआ या घटा हुआ फ्लोरोसेंस प्रदर्शित करता है। यह बायोसेंसर रेड और ग्रीन अपवर्ड संस्करणों के साथ-साथ ग्रीन डाउनवर्ड संस्करणों, और सबसेलुलर स्थानों को लक्षित करने वाले कई रेड और ग्रीन संस्करणों में उपलब्ध है। बायोसेंसर की प्रभावशीलता को दर्शाने के लिए, ग्रीन डाउनवर्ड संस्करण का उपयोग किया गया, जो cAMP बाइंडिंग पर फ्लोरोसेंस में कमी करता है। इस सेंसर का उपयोग करके दो प्रोटोकॉल प्रदर्शित किए गए हैं: एक 96-वेल प्लेट रीडिंग स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करता है जो हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के अनुकूल है और दूसरा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर सिंगल-सेल इमेजिंग का उपयोग करता है। प्लेट रीडर पर, 96-वेल प्लेटों में संवर्धित HEK-293 कोशिकाओं को 10 µM forskolin या 10 nM isoproterenol के साथ उत्तेजित किया गया, जिसने ग्रीन डाउनवर्ड संस्करण में फ्लोरोसेंस में तेजी से और भारी कमी को प्रेरित किया। बायोसेंसर का उपयोग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत मॉनिटर की गई व्यक्तिगत human airway smooth muscle (HASM) कोशिकाओं में cAMP स्तरों को मापने के लिए किया गया था। ग्रीन डाउनवर्ड बायोसेंसर ने forskolin या isoproterenol के साथ उत्तेजित होने पर कोशिकाओं की आबादी के समान प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित कीं। यह सिंगल-सेल परख 20x और 40x मैग्निफिकेशन पर बायोसेंसर के स्थान को देखने की अनुमति देती है। इस प्रकार, यह cAMP बायोसेंसर संवेदनशील और लचीला है, जो इमॉर्टलाइज़्ड और प्राथमिक दोनों कोशिकाओं में, तथा एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं की आबादी के साथ cAMP के रियल-टाइम मापन की अनुमति देता है। ये विशेषताएं cADDis को जीवित कोशिकाओं में cAMP सिग्नलिंग डायनेमिक्स का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाती हैं।