डायहाइड्रोफोलेट रेडक्टेज़ में एक इंजीनियर की गई डिसल्फाइड बोंड

Escherichia coli डायहाइड्रोफोलेट रेडक्टेज़ में प्रोलिन-39 के लिए सिस्टीन का प्रतिस्थापन ओलिगोन्यूक्लियोटाइड-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस द्वारा नए सिस्टीन को पहले से मौजूद सिस्टीन-85 के निकट स्थित करता है। जब म्यूटेंट प्रोटीन को E. coli साइटोजोल में व्यक्त किया जाता है, तो X-रे क्रिस्टलोग्राफिक विश्लेषण द्वारा सिस्टीन सल्फर परमाणु एक-दूसरे के साथ वान डेर वाल्स संपर्क में पाए जाते हैं लेकिन एक-दूसरे से सहसंयोजित नहीं होते हैं। डाइटियोनीट्रोबेनजोएट द्वारा इन-विट्रो ऑक्सीडेशन के परिणामस्वरूप अवशेष 39 और 85 के बीच एक डिसल्फाइड बोंड का गठन होता है, जिसकी आकृति सामान्यतः देखे गए बाएं हाथ के सर्पिल के निकट होती है। ऑक्सीकृत (क्रॉस-लिंक्ड) और घटित (अन-क्रॉस-लिंक्ड) म्यूटेंट एंजाइम के 2.0-ए-परिशोधित क्रिस्टल संरचनाओं की तुलना से पता चलता है कि एंजाइम अणु की स्थिति डिसल्फाइड बोंड के गठन द्वारा काफी प्रभावित नहीं हुई लेकिन अणु के तापीय गति के विवरण में बदलाव हुआ। डिसल्फाइड-क्रॉस-लिंक्ड एंजाइम कम से कम 1.8 kcal/mol अधिक स्थिर है जो अप्रत्यक्षता के संदर्भ में है, जैसा कि गुआनिडिन हाइड्रोक्लोराइड डिनैचरेशन द्वारा मापा गया, की तुलना में या तो जंगली प्रकार या घटित (अन-क्रॉस-लिंक्ड) म्यूटेंट एंजाइम के। फिर भी, क्रॉस-लिंक्ड रूप तापीय डिनैचरेशन के प्रति अधिक प्रतिरोधी नहीं है। इसके अलावा, गुआनिडिन हाइड्रोक्लोराइड डिनैचरेशन प्रोफाइल और यूरिया-ग्रेडिएंट पॉलियाक्रिलामाइड जेली में मध्यवर्ती की उपस्थिति इस बात का संकेत देती है कि डिसल्फाइड-क्रॉस-लिंक्ड एंजाइम की फोल्डिंग/अनफोल्डिंग पथ में महत्वपूर्ण रूप से बदलाव हुआ है।