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CRISPR/Cas9 अनुक्रम-विशिष्ट DNA cleavage को निष्पादित करने के लिए गाइड RNA (gRNA) अणु का उपयोग करता है और इसे कई जीवों में जीन संपादन के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। gRNA के किसी भी छोर पर संशोधन अक्सर Cas9/gRNA को निष्क्रिय कर देते हैं। अब तक, इन विओ में gRNA का उत्पादन केवल U6 और U3 snRNA प्रमोटरों का उपयोग करके किया गया है। हालांकि, U6 और U3 प्रमोटरों में प्रमुख सीमाएँ हैं, जैसे कि कोशिका विशिष्टता की कमी और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए अनुपयुक्तता। यहाँ, हम इन विट्रो और इन विओ दोनों में gRNAs के प्रभावी उत्पादन के लिए एक बहुपरकारी विधि प्रस्तुत करते हैं। हम एक कृत्रिम जीन का डिज़ाइन करते हैं जिसे RGR कहा जाता है, जो, एक बार ट्रांसक्राइब होने के बाद, डिज़ाइन किए गए gRNA के दोनों छोर पर रिबोजाइम अनुक्रमों के साथ RNA अणु उत्पन्न करता है। हम दिखाते हैं कि RGR के प्राथमिक ट्रांसक्रिप्ट्स स्व-उत्तेजित cleavage से वांछित gRNA उत्पन्न करते हैं, जो इन विट्रो और खमीर में DNA लक्ष्यों के अनुक्रम-विशिष्ट cleavage को प्रभावी रूप से मार्गदर्शित कर सकता है। RGR को किसी भी प्रमोटरों से ट्रांसक्राइब किया जा सकता है और इस प्रकार उचित प्रमोटरों के चयन पर आधारित कोशिका और ऊतक-विशिष्ट जीन संपादन की अनुमति देता है। CRISPR द्वारा उत्पन्न उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए अक्सर एंजाइम पाचन का उपयोग किया जाता है, जो उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के साथ बहुत संगत नहीं होते हैं। हमारी प्रणाली सार्वभौमिक प्राइमर के उपयोग की अनुमति देती है ताकि किसी भी gRNAs का इन विट्रो निर्माण किया जा सके, जिसे फिर gRNAs/CRISPR द्वारा उत्पन्न उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए Cas9 प्रोटीन के साथ उपयोग किया जा सकता है। संक्षेप में, हम विशिष्ट कोशिकाओं और ऊतकों में लक्षित उत्परिवर्तनों को उत्पन्न करने और उत्परिवर्तन का प्रभावी ढंग से पता लगाने के लिए एक बहुपरकारी विधि प्रदान करते हैं।
गाओ एट अल (सोमवार,) ने इस प्रश्न का अध्ययन किया।