ATM काइनेज़ परिवार के सदस्यों के संभावित सब्स्ट्रेट्स की सब्स्ट्रेट विशिष्टताएँ और पहचान

एटेक्सिया टेलेंजेक्टेशिया म्यूटेटेड (ATM) आयनकारी विकिरण के प्रति प्रतिक्रिया में p53 प्रोटीन को फॉस्फोराइलेट करता है, लेकिन AT कोशिकाओं का जटिल फेनोटाइप सुझाव देता है कि इसकी अन्य सेलुलर सब्स्ट्रेट्स भी होनी चाहिए। ATM और संबंधित काइनेज़ ATR और DNA-PK के लिए सब्स्ट्रेट्स की पहचान करने के लिए, हमने इन विट्रो काइनेज़ परीक्षणों का अनुकूलन किया और सामान्य फॉस्फोराइलेशन सहमति अनुक्रमों का निर्धारण करने के लिए एक त्वरित पेप्टाइड स्क्रीनिंग विधि विकसित की। ATM और ATR को इष्टतम इन विट्रो गतिविधि के लिए Mn(2+) की आवश्यकता होती है, लेकिन DNA समाप्तियों या Ku प्रोटीन की आवश्यकता नहीं होती है, जबकि DNA-PKCs को Mg(2+), DNA समाप्तियों और Ku प्रोटीन की आवश्यकता होती है। p53 पेप्टाइड उत्परिवर्तन विश्लेषण से, हमने पाया कि अनुक्रम S/TQ सभी तीन काइनेज़ के लिए एक न्यूनतम आवश्यक आवश्यकता है। इसके अलावा, हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड और स्रेरिन या थreonine के NH(2)-terminal के तुरंत नकारात्मक चार्ज वाले अमीनो एसिड सकारात्मक निर्धारक होते हैं और क्षेत्र में सकारात्मक चार्ज वाले अमीनो एसिड सब्स्ट्रेट फॉस्फोराइलेशन के लिए नकारात्मक निर्धारक होते हैं। हमने ATM के लिए एक सामान्य फॉस्फोराइलेशन सहमति अनुक्रम निर्धारित किया और ग्लूटाथियोन S-ट्रांसफरेज पेप्टाइड्स का उपयोग करके संभावित इन विट्रो लक्ष्यों की पहचान की। संभावित ATM इन विट्रो लक्ष्य प95/निब्रिन, Mre11, Brca1, Rad17, PTS, WRN, और खुद ATM (S440) शामिल हैं। Brca2, फॉस्फेटिडिल इनोसिटोल 3-काइनेज़, और DNA-5B पेप्टाइड्स को विशेष रूप से ATR द्वारा फॉस्फोराइलेट किया गया, और DNA लिगेज IV DNA-PK का एक विशिष्ट इन विट्रो सब्स्ट्रेट है।