नेक्स्ट-जनरेशन सीक्वेंसिंग के साथ सिंगल सैंपल्स में लो-एलेलिक फ्रैक्शन वेरिएंट्स की सटीक पहचान: ट्यूमर सबक्लोन रेजोल्यूशन में अनुप्रयोग

ट्यूमर नमूनों में आनुवंशिक रूप से भिन्न सबक्लोन्स को विभेदित करने के वर्तमान तरीकों में सोमैटिक म्यूटेशनों को एलेलिक आवृत्तियों द्वारा समूहीकृत करने की आवश्यकता होती है, जो नेक्स्ट-जनरेशन सीक्वेंसिंग डेटा पर वेरिएंट कॉलिंग प्रोग्राम लागू करके निर्धारित की जाती हैं। ऐसे प्रोग्राम वास्तविक पॉलीमॉर्फिज्म और सोमैटिक म्यूटेशनों को लाइब्रेरी तैयार करने और सीक्वेंसिंग के दौरान उत्पन्न होने वाले कृत्रिम (आर्टिफैक्चुअल) नॉन-रेफरेंस एलील्स से सटीक रूप से अलग करने के लिए विकसित किए गए थे। हालांकि, सबक्लोनल विश्लेषण के लिए सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन करने वाले के स्पष्ट संकेत के बिना कई वेरिएंट कॉलर्स मौजूद हैं, जिसमें निर्दिष्ट वेरिएंट आवृत्ति की सटीकता उतनी ही महत्वपूर्ण है जितनी कि यह सही ढंग से इंगित करना कि वेरिएंट मौजूद है या नहीं। इसके अलावा, सीक्वेंसिंग डेप्थ (एक जीनोमिक स्थिति को जितनी बार सीक्वेंस किया जाता है) लो-एलेलिक फ्रैक्शन वेरिएंट्स का पता लगाने और उनकी एलील आवृत्तियों को सटीक रूप से निर्दिष्ट करने की क्षमता को प्रभावित करती है। हमने दो सिंथेटिक सीक्वेंसिंग डेटासेट बनाए, और विशिष्ट अनुपातों में मिलाए गए वेरिएंट्स के साथ वास्तविक KRAS एम्प्लिकॉन्स को सीक्वेंस किया, ताकि यह मूल्यांकन किया जा सके कि वेरिएंट डिटेक्शन और एलेलिक आवृत्तियों के निर्धारण दोनों के मामले में कौन सा कॉलर सबसे अच्छा प्रदर्शन करता है। हमने लो-एलेलिक फ्रैक्शन वेरिएंट्स का पता लगाने के लिए आवश्यक सीक्वेंसिंग डेप्थ का भी मूल्यांकन किया। हमने पाया कि VarScan2 ने कुल मिलाकर सबसे अच्छा प्रदर्शन किया, जिसमें क्रमशः 10%, 5%, 2.5%, और 1% पर मौजूद वेरिएंट्स की सटीक पहचान के लिए 100×, 250×, 500×, और 1,000× की सीक्वेंसिंग डेप्थ आवश्यक थी।