拡張ゴールデンゲートアセンブリ：リガーション効率向上のためのオーバーハング強度の評価

要約 分子クローニングは、ルーチンでありながら必須の技術で、効率的なリガーションに大きく依存しており、ゴールデンゲートアセンブリ（GGA）を使用することで大幅に改善できます。GGAの重要な要素は、特異的に認識配列の下流で切断し、非対称なオーバーハングを含む様々なオーバーハングを生成するタイプIIS酵素の使用です。GGAにおける最近の進展には、活性が向上した新しく設計された酵素の開発が含まれます。さらに、すべての可能なオーバーハングを同時に研究できる高スループットGGAアッセイが、効率と忠実度が高い最適なGGA基質を特定し、複雑なアセンブリの設計を大いに促進しています。興味深いことに、これらのアッセイはリガーション効率とオーバーハングの安定性との間に予期しない相関関係を明らかにします。この観察に対する仮説の一つは、強いオーバーハングを持つ新たに加水分解されたDNA断片が容易に再リガートできるため、全体のプロセスが遅れるというものです。本論文では、ゲル電気泳動と数値計算の組み合わせを用いてこの仮説を検証し、最終的に従来のGGAアッセイで確立された条件下では正しくないことを特定します。10の断片からなるアセンブリを使用して、強いオーバーハングが高いGGA効率をもたらし、弱いオーバーハングが低い効率につながることを示します。これらの発見により、効率的なGGAアッセイのための最適なオーバーハングを提案でき、収量を大幅に増加させることが可能となります。