BreakTagを用いてCRISPR–Cas9二重鎖切断プロファイルと遺伝子編集精度を結びつける

要旨 Cas9は鈍部および段階的構成の両方でDNAを切断でき、異なる編集結果をもたらしますが、Cas9の切断の種類を決定する要因はほとんどわかっていません。本研究では、Cas9誘導のDNA二重鎖切断（DSBs）をプロファイリングし、Cas9切断の決定因子を特定するための多用途な手法であるBreakTagを開発しました。全体として、私たちは約3,500の単一ガイドRNAが標的とする150,000を超える内因性のターゲットおよびオフターゲット部位におけるSpCas9による切断を評価しました。約35%のSpCas9 DSBが段階的であり、切断の種類はDNA:gRNAの相補性およびエンジニアリングされたCas9変異体の使用に影響されることを発見しました。機械学習モデルは、Cas9切断がプロトスペーサー配列に依存しており、人間の遺伝的変異がCas9の切断の構成およびDSB修復結果に影響を与えることを示しています。修復結果と連動したCas9およびエンジニアリング変異体の切断の一致したデータセットは、Cas9媒介の段階的切断が正確でテンプレートに基づく予測可能な単一ヌクレオチド挿入と関連していることを示し、スシオンベースのgRNA設計が臨床的に関連する病原性単一ヌクレオチド欠失を修正するために使用できることを示しています。