プライマー不一致、アニーリング温度、PCRサイクル数の16S rRNA遺伝子ターゲティング細菌群集分析への影響

環境サンプルの複雑な細菌群集を探求する試みとして、16S rRNA遺伝子の系統的に保存された領域にハイブリダイズするプライマーが広く使用されていますが、差別的増幅は認識された問題です。多重PCRの好みの増幅に関連するバイアスを「ユニバーサル」な細菌特異的プライマーを使用して調査し、プライマー不一致、アニーリング温度、PCRサイクル数の影響に焦点を当てました。テンプレート-産物比の歪みは、あらかじめ定義されたテンプレート混合物と環境サンプルを用いて末端制限断片長多型分析により測定されました。2つの株の1:1ゲノムDNAテンプレート混合物が使用されたとき、63Fプライマーに固有のプライマー不一致は重大なバイアスを示し、完全に一致する配列を含むテンプレートの好みの増幅を示しました。好みの増幅の程度は、47度Cから61度Cに至るまでのアニーリング温度の上昇に対してほぼ指数関数的な関係を示しました。27Fプライマーに関しては、ターゲット配列との不一致がないため、さまざまなアニーリング温度の負の影響は観察されませんでした。PCRサイクル数はテンプレート-産物比にわずかな影響を与えました。環境サンプルに関する追加テストの結果として、PCRの特異性を維持しながら好みの増幅を大幅に減少させるために低いアニーリング温度の使用が推奨されます。