多色神経活動イメージングのための遺伝子符号化カルシウム指標と光遺伝学との組み合わせ

遺伝子符号化カルシウム指標（GECIs）は、システム神経科学における強力なツールです。ここでは、熱安定性の赤色蛍光タンパク質mRubyの円環的排列から設計された赤色の単一波長GECI「RCaMP」について説明します。mRuby、赤色センサーRCaMP、および最近発表された赤色GECI R-GECO1の高解像度結晶構造は、センサーのCa(2+)-結合状態におけるクロモフォア環境と異なる指標の設計されたタンパク質ドメイン間のインターフェースについての洞察を提供します。私たちは、ショウジョウバエ幼虫、線虫Caenorhabditis elegans、幼魚ゼブラフィッシュでin vitroおよびin vivoでRCaMPセンサーの生物物理的特性と性能を特徴づけました。さらに、同じ細胞内（ミトコンドリアと体細胞Ca(2+)を記録）および神経細胞と星状膠細胞の2つの細胞集団間での2色カルシウムイメージングを実証します。最後に、チャネルロドプシン-2（ChR2）または赤方偏移亜種による神経活性化と、RCaMPまたはGCaMPによる活動イメージングを同時に実施する統合光遺伝学実験を行い、ChR2/RCaMPペアが独立してアドレス可能なスペクトルチャネルを提供します。このパラダイムを使用して、這っているC. elegansにおける自然光およびChR2誘発筋収縮のカルシウム応答を測定します。私たちは、神経細胞における活動電位誘発蛍光増加、光漂白、フォトスイッチングの観点からRCaMPセンサーとR-GECO1を系統的に比較します。R-GECO1はRCaMPよりも高いCa(2+)親和性と大きなダイナミックレンジを示しますが、青と緑の光での著しい光活性化が観察され、R-GECO1を用いた統合チャネルロドプシンベースの光遺伝学はアーティファクトの影響を受ける可能性があることを示唆しています。最後に、合理的設計によってGCaMPから構築された青色、シアン色、黄色の変異体を作成し、テストします。この設計された色彩変異体のセットは、機能的イメージングおよび光遺伝学における新しい実験を促進します。