m3ムスカリン受容体ダイマーの同定と分子特性

いくつかの研究は、ムスカリン受容体がダイマーまたはオリゴマー配列を形成する可能性があることを示唆していますが、直接的には証明していません。この問題により直接的に取り組むために、ラットm3ムスカリン受容体の修正バージョン（m3'と呼ばれる）をモデルシステムとして使用した一連の生化学実験を設計しました。m3'受容体を発現するCOS-7細胞から調製された膜抽出物を非還元条件下でウエスタンブロット解析を行ったところ、推定受容体単量体、ダイマーおよびオリゴマーに相当するサイズのいくつかの免疫反応性種が観察されました。しかし、還元条件下では、単量体受容体種のみが検出可能な免疫反応性タンパク質として示され、二硫化物結合したm3受容体複合体の存在と一致しました。ラット脳膜に存在する天然のm3ムスカリン受容体を分析した際にも同様の結果が得られました。SH基アルキル化試薬であるN-エチルマレイミドの高濃度の存在下で行った対照実験は、細胞抽出物の調製中に二硫化物結合形成が人工的に発生しなかったことを示唆しました。異なるエピトープタグ付きm3'受容体構造体を使用した共同免疫沈降研究により、m3'受容体ダイマー/マルチマーの形成が確認されました。さらに、これらの研究は、m3'受容体が非共有結合性に関連付けられた受容体ダイマーを形成でき、m3'受容体ダイマー形成が受容体サブタイプ特異的であることを示しました。免疫学的研究は、m3'受容体ダイマー/マルチマーが細胞表面で豊富に発現していることを示しました。部位特異的変異導入研究は、2つの保存された細胞外システイン残基（Cys-140およびCys-220）が二硫化物結合したm3'受容体ダイマーの形成において重要な役割を果たすことを示しました。これらの結果は、ムスカリン受容体ダイマーの存在に関する最初の直接的な証拠を提供し、Gタンパク質共役受容体のダイマー化/オリゴマー化の特異性と分子の多様性を強調しています。