酵母Saccharomyces cerevisiaeからのDNAトポイソメラーゼIIの誘導過剰発現、精製および活性部位マッピング

酵母DNAトポイソメラーゼIIの過剰発現は、遺伝子TOP2のコーディング配列を誘導プロモーターPGAL1の下流に配置した多コピーのプラスミドを用いて達成されました。簡単な精製手順を使用することで、高い特異的活性を持つ酵素を数リットルの培地からミリグラム単位で得ることができます。薬剤VM-26（テニポサイド）の存在下で、酵素分子の90%以上がタンパク質変性剤である十二烷基硫酸ナトリウムの添加によりDNAに共有結合します。この共有複合体の形成は、酵素が一時的にDNAを切断する際にDNAに共有的に結合するチロシン残基をマッピングするために使用されました。DNA-タンパク質複合体をトリプシンで徹底的に消化した後、DNAに結合したペプチドが精製され、直接配列決定されて、その活性部位残基がTyr-783であることが確認されました。