異常環境における酵素の活性調整: ジメチルホルムアミドにおける触媒活性のためのサブチリシンEの逐次ランダム変異導入。

ランダム変異導入は、極めて非自然的な環境、すなわち極性有機溶媒の高濃度下で機能するプロテアーゼサブチリシンEを設計するために使用されました。逐次的な変異導入とスクリーニングにより、野生型サブチリシンに比べて60%ジメチルホルムアミド中でペプチド基質を256倍効率良く加水分解する変異体（PC3）が得られました。PC3サブチリシンEおよび異なるアミノ酸置換の組み合わせを含む他の変異体は、ジメチルホルムアミドやその他の有機媒体におけるトランスエステリフィケーションやペプチド合成のための効果的な触媒です。四つの効果的なアミノ酸置換（D60N、D97G、Q103R、N218S）を含む変異体から始まり、三回の逐次変異導入とスクリーニングの過程で、六つの追加変異（G131D、E156G、N181S、S182G、S188P、T255A）が生成されました。10の置換は酵素の一面に集中しており、活性部位および基質結合ポケットの近くに位置し、コア二次構造要素を結ぶループ内にあり、異なる供給源のサブチリシンにおいて相当の配列変異性を示しています。これらの変異する表面ループは、サブチリシンの活性を「調整」するための効果的なハンドルです。PC3における10のアミノ酸置換のうち7つは、他の天然サブチリシンにも見られます。自然発生する配列間には類似した三次元構造をコードするものの間で大きな変異性が見られます。この配列の柔軟性を利用して、in vivoで機能するためにこれまで開発されていない（または必要とされていない）特性を持つ酵素を設計することが可能です。