Compact Cas9d에 의한 DNA 타겟팅 및 그 조상 복원

초록 II-A형 CRISPR 효과기 SpCas9은 효율적이고 프로그래밍 가능한 게놈 편집 도구로 널리 인기를 끌고 있다. 그러나 현재 시스템의 몇 가지 한계를 극복할 수 있는 새로운 콤팩트 변종에 대해서는 여전히 많은 것이 알려져 있지 않다. 최근에는 Cas9d(II-D형 CRISPR-Cas 효과기)를 포함한 배양되지 않은 미생물의 메타게놈 분석을 통해 포유류 세포에서 게놈 편집이 가능한 고도로 콤팩트한 뉴클레이스들을 가진 대안 CRISPR-Cas 시스템이 발견되었다. 여기에서는 여러 기능적 상태에서의 Cas9d 뉴클레이스의 크라이오-EM 구조(747 아미노산 길이)를 보고하며, REC2 도메인 삽입에서의 형태 전환을 포함한 DNA 타겟팅의 단계적 과정을 밝혀낸다. 우리의 구조는 작고 유연한 단백질 도메인을 고정하고 DNA 타겟 인식을 촉진하는 구조적 지주로 작용하는 면밀하게 접힌 가이드 RNA에 대한 통찰을 제공한다. 우리는 sgRNA가 최대 약 25%까지 절단될 수 있으나 여전히 생체 내에서 활성을 유지한다는 것을 발견하였다. 또한 NGG PAM을 선호적으로 타겟팅함에도 불구하고 Cas9d는 PAM 인식을 위한 독특한 메커니즘을 보인다. 마지막으로, 포유류 세포에서 강력한 뉴클레이스 활성을 보이는 800 아미노산 이하의 첫 번째 Cas9d를 확인하였다. 조상 서열 복원을 사용하여 우리는 Cas9d 계통의 다양성을 확장함으로써 효율적인 게놈 편집이 가능한 콤팩트 뉴클레이스를 생성할 수 있음을 보여준다. 종합적으로 우리의 결과는 다양한 II형 CRISPR-Cas 시스템의 진화와 DNA 타겟팅에 대한 메커니즘 통찰을 제공하며, 최소한의 RNA 유도 DNA 뉴클레이스의 미래의 합리적 재설계를 위한 분자 청사진을 제공한다.