스타르가르트병에서 ABCA4 스플라이싱 변이를 감소시키기 위한 RNA 표적 CRISPR-Cas13 및 조작된 U1 시스템의 활용

초록 대안적 스플라이싱(alternative splicing) 과정의 조절 이상은 비정상적인 mRNA 전사체를 초래하여 기능 장애 단백질이나 넌센스 매개 분해(nonsense-mediated decay)를 유발함으로써 광범위한 비정상 스플라이싱 질환을 일으킵니다. 대안적 스플라이싱 과정을 표적화하는 치료 전략의 개발은 잠재적으로 mRNA 스플라이싱을 질환 동형(isoform)에서 정상 동형으로 전환하고 기능적 단백질을 복원할 수 있습니다. 개념 증명으로서, 우리는 ABCA4 유전자의 양대립유전자 변이로 인해 발생하는 상염색체 열성 유전성 망막 질환인 스타르가르트병(STGD1)에 주목했습니다. ABCA4의 스플라이싱 변이 c.5461-10T>C 및 c.4773+3A>G는 각각 엑손 39-40 및 엑손 33-34의 결실(skipping)을 유발합니다. 본 연구에서는 4가지 CRISPR-Cas13 시스템(CASFx-1, CASFx-3, RBFOX1N-dCas13e-C, RBFOX1N-dPspCas13b-C)과 조작된 U1 시스템(ExSpeU1)을 포함하여 이러한 ABCA4 스플라이싱 결함을 조절하기 위한 다양한 RNA 표적 시스템의 효능을 비교했습니다. 인간 망막 색소 상피 ARPE19에서 ABCA4 변이를 포함하는 미니진(minigene) 시스템을 사용한 결과, RBFOX1N-dPspCas13b-C가 가장 우수한 성능을 보이는 CRISPR-Cas 시스템으로 나타났으며, 비정상 스플라이싱된 ABCA4 c.5461-10T>C 변이를 최대 80%, ABCA4 c.4773+3A>G 변이를 최대 78%까지 감소시켰습니다. 이에 비해 단일 ExSpeU1 전달은 비정상 스플라이싱된 ABCA4 c.4773+3A>G 변이를 최대 84%까지 효과적으로 감소시킬 수 있었습니다. 우리는 CRISPR 기반 및 U1 스플라이싱 조절의 효과가 sgRNA/snRNA 표적 서열에 크게 의존함을 관찰하였으며, 이는 비정상 스플라이싱 전사체의 효율적인 표적화를 위해 최적의 sgRNA/snRNA 설계가 결정적임을 강조합니다. 종합적으로, 본 연구는 ABCA4에 대한 비정상 스플라이싱 전사체를 감소시키기 위한 RNA 표적 CRISPR-Cas 기술 및 조작된 U1 활용의 잠재력을 입증하여 STGD1 치료를 위한 유전자 치료제 개발을 촉진하는 중요한 발판을 제공합니다.