Enhancer cooperativity in gene regulation over large genomic distances

Enhancer sind eine Klasse von DNA-Sequenzen, die die Genexpression in räumlich-zeitlicher Weise regulieren. Jüngste Studien zeigen, dass die Anzahl der Enhancer im Genom die Zahl der Gene deutlich übersteigt. In vielen Genomregionen sind Enhancer zu Clustern angeordnet, die gemeinsam die Expression ihrer Zielgene steuern. Dennoch sind die Mechanismen, durch die einzelne Enhancer innerhalb solcher Cluster kooperieren, um die Genexpression zu modulieren, bislang nur unzureichend verstanden. Die Manipulation von Enhancern in ihrem nativen genomischen Kontext ist arbeitsintensiv und eignet sich für High-Throughput-Studien kaum. Insbesondere für cis-Elemente mit schwacher Enhancer-Aktivität reichen herkömmliche Loss-of-Function-Ansätze oft nicht aus, um ihre Funktion in endogenen Regionen vollständig zu erfassen. In dieser Dissertation habe ich eine Zelllinie mit einem synthetischen Lokus etabliert, der die effiziente Integration von Enhancer-Sequenzen in drei definierten Abständen zu einem fluoreszenten Reportergens ermöglicht. Auf diese Weise lassen sich regulatorische Landschaften systematisch von Grund auf rekonstruieren. Mit diesem System habe ich mehrere Enhancer einzeln in definierten Abständen zu demselben Promotor integriert. Dabei zeigte sich, dass alle getesteten Enhancer mit zunehmender Distanz zum Promotor eine verringerte Aktivierungskapazität aufwiesen, wobei das Ausmaß dieses Effekts je nach intrinsischer Stärke der Enhancer variierte. Um tiefere Einblicke in die Kooperativität von Enhancern bei der Genregulation zu gewinnen, wurden Enhancer-Paare in den synthetischen Lokus integriert, wobei jeder Enhancer in einem definierten Abstand zum Promotor positioniert war. Die Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von schwachen und starken Enhancern zu einer deutlich erhöhten Expression führte, wenn der schwache Enhancer zwischen dem starken Enhancer und dem Promotor lag. Dies weist darauf hin, dass Enhancer-Synergie sowohl von der intrinsischen Aktivität als auch von der relativen genomischen Positionierung abhängt. CTCF-Bindestellen und andere strukturelle Elemente sind dafür bekannt, Enhancer–Promotor-Interaktionen zu modulieren. Um ihren Beitrag zur Enhancer-Kooperativität in unserem synthetischen System zu untersuchen, habe ich zwei CTCF-assoziierte Regionen in mehreren Zelllinien mit synergistischen Enhancer-Paaren entfernt. Die Deletion dieser CTCF-Regionen führte zu einem weiteren Anstieg der Reportergenexpression, was darauf hinweist, dass Enhancer-Synergie durch CTCF-Bindestellen beeinflusst wird. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Transkription eines Gens nicht durch einen einzelnen Faktor bestimmt wird, sondern aus dem Zusammenspiel von Enhancer-Kooperativität und strukturellen Elementen hervorgeht.