환경 샘플에 대한 드롭렛 디지털 PCR 사용의 도전 과제

드롭렛 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)은 매우 낮은 수치로 존재하는 경우에도 핵산을 검출하고 정량화하는 데 사용되는 방법입니다. 그것은 임상 연구에 가치가 있음이 입증되었지만, 환경 연구에서는 널리 채택되지 않았습니다. 그러나 몇 가지 한계에도 불구하고 ddPCR은 환경 샘플에 대해 고전적인 qPCR보다 더 나은 선택이 될 수 있습니다. 환경 샘플의 화학적 및 생물학적 조성이 복잡하여 임상 연구에 맞춘 프로토콜은 적합하지 않으며, 결과 해석이 어렵습니다. 우리는 현장 연구에서 유래한 환경 DNA 샘플을 사용하여 환경 샘플에 대한 프로토콜을 결정했습니다. 샘플에는 토양 곰팡이 Rhizophagus irregularis로 접종된 현장 토양(환경 양성 대조군), 접종되지 않았고 표적 곰팡이가 자연적으로 존재하지 않았던 현장 토양(환경 음성 대조군), 두 현장 카테고리의 뿌리 샘플이 포함되었습니다. 토양 억제제의 영향을 통제하기 위해 순수한 곰팡이 포자로부터 추출한 유기체 대조군의 DNA 샘플도 포함했습니다(유기체 양성 대조군). 마지막으로, 템플릿 DNA 대신 PCR 반응 시약과 핵산 분해 효소가 없는 물만 포함된 무 템플릿 대조군을 포함했습니다. 원본 데이터를 사용하여 뿌리 및 토양 샘플의 해상도가 저조한 데 기여하는 요소를 조사하고 정확성과 반복성을 보장하기 위한 최선의 실천 방법을 제안했습니다. 더 나아가, 수동 및 자동 임계값 결정 방법을 평가하고 환경 샘플에 더 적합한 다중 대조군 기반의 새로운 프로토콜을 제안합니다.