알파바이러스를 위한 세미-내스트 역전사-폴리메라제 연쇄반응에 의한 속 특이적 검출

알파바이러스를 위한 속 특이적 검출을 위해 역전사-폴리메라제 연쇄반응 (RT-PCR)이 개발되었다. 사용 가능한 출판된 서열을 기반으로, 모든 알파바이러스 종의 비구조 단백질 1 유전자 내의 보존된 영역에 하이브리다이제이션을 보장하기 위해 분산 프라이머가 설계되었다. 200 마이크로리터의 감염된 세포 배양 상등액에서 추출한 RNA를 사용하여 27종의 알파바이러스에서 예상되는 434 염기쌍 (bp) cDNA 조각이 증폭되었다. 또한, 베네수엘라 말 뇌염 (VEE) 바이러스의 8개 균주와 신디비스 바이러스의 10개 균주도 증폭되었다. 증폭산물의 바이러스 기원은 제한 효소 분석과 출판된 서열 데이터를 기반으로 한 예상 절단 패턴과의 비교를 통해 확인되었다. 지금까지 알려지지 않은 뉴클레오타이드 조성을 가진 알파바이러스 종의 PCR 생성물이 서열 분석되었다. 전방 프라이머에서 약 120 뉴클레오타이드 하류에 또 다른 전방 프라이머 설계를 위한 충분한 상동성을 보이는 영역이 발견되어 세미-내스트 PCR에 사용되었다. 조사된 모든 바이러스에 대해 예상되는 310-bp 세미-내스트 조각이 입증되었다. RT-PCR의 감도는 VEE 바이러스 참조 균주인 트리니다드 당나귀에 대해 약 1,200 플라크 형성 단위 (PFU)였다. 세미-내스트 PCR 이후의 검출 한계는 1.2 PFU였다. 인간 혈청의 존재에 의해 감도가 저해되지 않아, 이 검사는 바이러스 혈증이 있는 개인에 대한 응용에 적합하게 되었다. 설명된 RT-PCR 분석에 의해 감염된 생쥐 뇌 조직에서 치쿤구니야 바이러스 RNA가 증폭되었다. 우리의 데이터는 세미-내스트 RT-PCR이 알파바이러스 감염, 포스트모템 진단을 포함한 신속한 선별 및 진단에서 바이러스 분리의 고감도 대안으로 적용될 수 있음을 시사한다. 증폭산물 서열 데이터의 계통 발생 분석을 통해 알파바이러스 속 내에서 6개의 유전형이 확인되었다.